В настоящее время большое внимание привлекает такая нейробиологическая модель долговременных модификаций поведения как долговременная сенситизация. Она позволяет успешно исследовать мембранные механизмы формирования устойчивых очагов возбуждения в нервной системе животного. Долговременная сенситизация, являясь видонеспецифическим феноменом, т.е. присущим животным любого уровня организации, позволяет проводить исследование реакций высших животных на относительно простых объектах или моделях, удобных для анализа. Серотонин – один из широко распространенных медиаторов нервной системы. Множество экспериментальных данных свидетельствуют о том, что моноамины, включая серотонин, опосредуют сенситизацию оборонительного рефлекса. Для увеличения уровня серотонина широко используется непосредственный предшественник синтеза серотонина 5-окситриптофан (5-HTP). S100 – это группа белков, характеризуемых наличием Са++- связывающих доменов. Целью работы явилось исследование роли антител к кальций-связывающему белку S100 на формирование долговременной сенситзации, влияние введения 5НТР на формирование долговременной сенситизации, а также влияние инъекции 5НТР после введения антител к кальций-связывающему белку S100 на выработку долговременной сенситизации. Проведенное исследование показало, что введение антител к кальций-связывающему белку S100 блокировало выработку долговременной сенситзации. Введение 5НТР не влияло на ход формирования долговременной сенситизации. Инъекция 5НТР после введения антител к кальций-связывающему белку S100 снимала протекторный эффект AS 100 на выработку долговременной сенситизации.
К настоящему времени многие исследователи приходят к выводу, что некоторые факторы патогенности бактерий, вызывающие заболевания у животных и растений, имеют общее происхождение и функционально сходны. С другой стороны, и механизмы защиты от патогенов у растений и животных имеют общие черты. Некоторые не фитопатогенные бактерии {EscherichiacoliO157:H7, Salmonellaenterica, Enterococcusfaecalis, Staphylococcusaureus) в условиях эксперимента способны инфицировать растительные ткани. Многолетние исследования Y. pseudotuberculosisпоказали, что для поддержания жизнеспособности и численности популяции во внешней среде эти микроорганизмы используют растительные субстраты, которые являются основными факторами передачи возбудителя псевдотуберкулёза человеку. Ранее нами установлено, что бактерии псевдотуберкулеза и некоторые их токсины разрушают клетки каллусной культуры женьшеня. Микроорганизмы проникали в цитоплазму растительных клеток и лизировали последние, причем бактерии в ассоциации с клетками погибали. Подобная динамика взаимодействия бактерий с растениями привела к идее исследовать иммунный ответ растений на действие патогена. В связи с этим была поставлена задача выявить индукцию экспрессии защитных генов женьшеня – фенилаланин аммиак-лиазы (PAL) и Р-1,3-глюканазы (GLU), ответственных за синтез вторичных метаболитов и PR-2 (pathogenesis-related) белков, соответственно. В эксперименте использовали вирулентный штамм Y. pseudotuberculosisI серовара, термостабильный (ТСТ) и термолабильный (ТЛТ) токсины данного микроорганизма, а также каллусную культуру женьшеня PanaxginsengC.A. Меу., трансформированную "пустым" бинарным вектором pPCV002. Было установлено, что при действии Y. pseudotuberculosisи их токсинов экспрессия генов PALженьшеня в 2-4 раза превосходит таковую в неинфицированных клетках (контроль). Большим стимулирующим действием обладали бактерии и ТЛТ. Также под действием иерсиний и их токсинов уже в первые сутки культивирования в 2-3 раза возрастала экспрессия гена GLUпо сравнению с контролем. Повышенная экспрессия генов PALи GLUсохранялась и на 3 сутки воздействия иерсиний. По-видимому, ослабление иммунного ответа к третьим суткам культивирования связано с массовой гибелью клеток женьшеня. Таким образом, клетки женьшеня активизируют экспрессию генов фенилаланин аммиак-лиазы и Р-1,3-глюканазы под действием иерсиний и их токсинов, что свидетельствует о развитии иммунного ответа в растительных клетках.
Микроорганизмы, способные диссимиляционно восстанавливать минералы трехвалентного железа Fe (III), не образуют отдельной филогенетической группы и найдены в различных таксонах прокариот. Из литературных источников известно несколько физиологических стратегий восстановления нерастворимых минералов Fe (III) микроорганизмами. Целью данной работы было исследование филогенетического состава микробного сообщества, восстанавливающего нерастворимые минералы Fe (III) в качестве акцептора электронов в условиях прямого и ограниченного контакта клеток микроорганизмов с поверхностью минерала. Из осадка и воды пресного термального источника Долины Гейзеров Камчатки были получены накопительные культуры термофильных анаэробных железовосстанавливающих микроорганизмов (ТЖВМ). Накопительные культуры инкубировали при температуре 65°С и рН 6,8. Донорами электронов служили ацетат и лактат. В качестве акцепторов электронов выступали ферригидрит, доступный для клеток микроорганизмов, и ферригидрит, изолированный от прямого контакта с клетками путем заключения его в гранулы альгината (1,5%). Для исследования возможного использования прокариотами экзогенных медиаторов железоредукции в среду добавлялся антахинон-дисульфонат (0,1 мМ). Из 6 устойчивых накопительных культур ТЖВМ (3 последовательных 5% (об.) пересева) была выделена тотальная ДНК. Фрагменты генов 16S рРНК были амплифицированы с использованием таксон-специфичных праймеров к домену Bacteria и разделены с помощью метода денатурирующего градиентного гель-электрофореза с последующим определением нуклеотидной последовательности индивидуальных микроорганизмов. Сравнительный анализ генов 16S рРНК двух накопительных культур, восстанавливающих Fe (III) путем прямого контакта клеток с поверхностью минерала, показал наличие двух ТЖВМ Sphingomonassp. и Carboxydocellasp. со степенью сходства нуклеотидных последовательностей с ближайшими культивируемыми организмами Sphingomonasechinoids- 90% и Carboxydocellaferrireducens- 97%, соответственно. Четыре накопительные культуры восстанавливали ферригидрит в отсутствие прямого контакта клеток с поверхностью минерала. Две накопительные культуры ТЖВМ были способны восстанавливать железо с помощью эндогенных медиаторов и содержали представителей типа Firmicutes, класс Clostridia – Carboxydothermussp., Desulfotomaculumsp., Thermobrachiumsp., Caldicellulosiruptorsp., Carboxydothermussp., Carboxydocellasp. Для большинства родов охарактеризованных бактерий была показана способность к железоредукции. Две накопительные культуры восстанавливали ферригидрит с помощью экзогенного медиатора железоредукции. Филогенетический анализ этих накопительных культур выявил представителей двух типов: Firmicutes, класс Clostridia – Carboxydothermussp., Thermincolasp., Gelriasp., класс Thermolithobacteria – Thermolithobactersp. и Thermotogae, класс Thermotogae -Fervidobacteriumsp., Thermotogasp. Проведённый филогенетический анализ выявил представителей термофильных анаэробных бактерий, способных восстанавливать нерастворимые минералы Fe (III) в условиях прямого и ограниченного контакта клеток микроорганизмов с поверхностью минерала, относящихся к различным филогенетическим и физиологическим группам.
Культуры микроорганизмов и продукты их метаболизма применяются во всех сферах жизнедеятельности человека благодаря их биологической активности, связанной со способностью продуцировать различные биологические вещества. К ним относятся и бациллы. Они являются продуцентами различных биологически активных веществ: ферментов, антибиотиков, витаминов и т.д. Поскольку они выделяют ферменты в культуральную жидкость, получение их препаратов не представляет особых трудностей. Многие виды обладают антагонистическими свойствами и вырабатывают большинство антибиотиков, известных на сегодняшний день. Целью работы было получение культур бацилл, перспективных в качестве продуцентов ферментов. Было выделено 50 штаммов бактерий рода Bacillussubtilisиз почвы, зерна, муки, хлебобулочных изделий. Дана
Читать далее…
Потеря внимания в дремотном состоянии у операторов сложных технических систем является одной из основных причин возникновения аварийных ситуаций. В частности, засыпание водителей за рулём является причиной от 30 до 50% аварий со смертельным исходом по различным экспертным оценкам. Сонливость вызывает значительное ухудшение внимательности и времени реакции операторов. Это делает актуальной задачу создания автоматизированной системы мониторинга состояния оператора в реальном времени. Известно, что с возникновением дремотного состояния хорошо коррелируют многие физиологические показатели, в частности, электроэнцефалограмма (ЭЭГ). Благодаря широкому распространению компьютеров становится возможным применять ресурсоемкие вычислительные методы для диагностики состояния оператора по ЭЭГ в реальном времени. Для проверки возможности распознавания дремотного состояния по ЭЭГ были проведены эксперименты с двадцатью испытуемыми в состоянии депривации сна на симуляторе вождения автомобиля. В эксперименте регистрировались: ЭЭГ от четырех электродов, отклонение машины от центра дороги, а также проводилась видеозапись лица испытуемого. Два последних показателя использовались для независимой оценки дремотного состояния испытуемого и служили основой для разработки классификатора. Исследовалось несколько методов классификации: метод Титце (Tietze), метод CSP (Common Spatial Pattern [1]), метод линейного дискриминантного анализа (LDA) и метод Байеса. Метод Титце основан на выделении в ЭЭГ вспышек альфа-ритма, который достоверно увеличивается с наступлением состояния дремоты, и уже применялся для разработки классификаторов уровня сонливости ([2]). Метод CSP основан на выборе в многомерном пространстве направления, проекции на которое множеств точек, относящихся к разделяемым классам событий, имеют максимальное отношение. Этот метод успешно использовался для классификации ментальных состояний по ЭЭГ при разработке интерфейсов мозг-компьютер (Brain-Computer Interface, BCI). Методы LDA и Байеса ранее не применялись для распознавания состояния сонливости по ЭЭГ. Результаты, полученные всеми рассмотренными методами, хорошо согласуются друг с другом и хорошо коррелируют (от 70 до 96%) с оценкой состояния испытуемых по видеозаписи, причём новые методы показывают более высокую эффективность, чем метод Титце. Показана принципиальная возможность эффективного выявления ранних стадий дремоты по ЭЭГ с использованием малого количества электродов, что делает возможным создание автоматизированной системы оценки состояния оператора, пригодной к применению в массовых масштабах.
Читать далее…
Метод компостирования различных органических отходов, в т.ч. таких субстратов, как отходы растениеводства, используется для получения органических удобрений. Получение компостов невозможно без участия в этом процессе самых разнообразных микроорганизмов, как бактерий, так и грибов, растущих в мезофильных или термофильных условиях. Активность такого сообщества микроорганизмов зависит от состава и соотношения компонентов, подвергающихся биоразложению. В ходе проведенной работы были изучены особенности формирования микрофлоры в результате процессов, происходящих при компостировании растительных остатков. Объектами исследования служили несколько субстратов, использовавшихся для закладки компостной кучи – растительные остатки кустов томатов (цветки, листья и стебли, корни перед закладкой), контрольная почва с участка, на котором была заложена куча, а также проба почвы с компостной кучи (через 1,5 мес. после закладки). Компостная куча закладывалась слоями. Основу каждого слоя составляли кусты томатов, собранные на полях после сбора урожая, каждый из слоев засыпан почвой и свежей состриженной газонной травой. Размер ~ 1×1 м, высота около 50 см. В первые двое суток после закладки кучи наблюдалось повышение температуры до 45°С, что говорило о резкой интенсификации микробиологических процессов превращения веществ и энергии. В последующие дни произошло остывание компостной кучи, и на момент взятия образца (через 1,5 месяца после закладки) ее температура была равна температуре воздуха (11°С). Возможно, это связано со сменой сезона года. Согласно проведенным исследованиям, интенсивность микробиологических процессов в компостной куче понижается по сравнению с процессами, происходящими в филлосфере и ризосфере и ризоплане растений-субстратов. Наиболее существенно снижаются процессы круговорота азота, особенно азотфиксация. В то же время в компостной куче наблюдается усиление процесса аэробного разложения целлюлозы. Таким образом, в первые месяцы компостирования отходов растениеводства наиболее интенсивно идут процессы разложения целлюлозы. Процессы круговорота азота несколько замедляются. Но поскольку компостирование занимает довольно продолжительное время, то возможна последующая интенсификация процессов круговорота азота, особенно азотфиксации. В настоящее время эксперимент по изучению особенностей формирования микрофлоры в результате компостирования продолжается.
Количество выделенных и изученных внутриклеточных протеолитических ферментов, по отношению к экстрацеллюлярным протеиназам, несравнимо мало. В первую очередь, это связано со сложностью разрушения клеточной стенки бацилл, а также с меньшей стабильностью внутриклеточных белков. Был подобран оптимальный метод разрушения клеток Bacillusintermedius3-19 с целью получения максимального количества внутриклеточных белков. Было проведено сравнение трёх методов разрушения клеток бацилл: механическое растирание с абразивом, ферментативное разрушение (обработка лизоцимом), воздействие ультразвука. Культуру В. intermediusвыращивали на жидкой среде в течение 16 ч, после чего клетки осаждали центрифугированием и отмывали от культуральной жидкости 0,8% раствором NaCl. Для ферментативного разрушения клеточную массу смешивали в соотношении 1:3 с буферным раствором Tris-HCl (0,015 М, рН 7,5), содержащим 0,3% КС1 и лизоцим (2 мг/мл). Полученную смесь инкубировали в течении 30 мин. при 37°С, после чего центрифугировали 15 мин. при 10 тыс. об/мин. Количество внутриклеточных белков в супернатанте составило 2,62 мг/мл. Микроскопирование осадка показало наличие неразрушенных протопластов. По-видимому, лизоцим не оказывает влияния на цитоплазматическую мембрану клеток, что не позволяет внутриклеточным белкам перейти в раствор. Данный метод необходимо сочетать с механической или ультразвуковой обработкой. Растирание клеток проводили, смешивая клеточную массу в соотношении 1:1 с буферным раствором Tris-HCl (0,015 М, рН 7,5), содержащим 0,3% КС1, и добавляя абразив. После обработки смесь центрифугировали. Содержание белка в супернатанте – 5 мг/мл. Недостатками метода являются высокая трудоемкость и длительность обработки. Воздействию ультразвука подвергали суспензию клеток (10%) в буферном растворе Tris-HCl (0,01M). Буфер варьировал по значениям рН (8,0 и 9,0), а также содержанию лизоцима (0 и 1 мг/мл). Обработку проводили в течение 1 мин. Наиболее полное разрушение клеток (количество экстрагированного белка – 19,1 мг/мл) наблюдалось в условиях рН8,0 и в присутствии лизоцима. Увеличение времени ультразвукового воздействия приводило к снижению количества белка в клеточном экстракте.
Субтилизиноподобные протеиназы широко распространены среди живых организмов, они были обнаружены у архей, бактерий, грибов, дрожжей и высших эукариот. Экстрацеллюлярные протеолитические ферменты, относящиеся к субтилизинам, выделены из многих представителей рода Bacillus. В то же время, внутриклеточные ферменты этого типа исследованы только у нескольких бацилл: В. amyloliquefaciens, В. licheniformisи В. subtilis. Объектом нашего исследования были внутриклеточные сериновые протеиназы. В. intermedius3-19. Грубый клеточный экстракт получали путем ультразвуковой обработки клеток, выращенных на жидкой питательной среде в течение 16 часов. Специфическую активность субтилизиноподобных сериновых протеиназ определяли с помощью синтетического субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa. Наличие данной активности в экстракте определяли качественно, через 16 часов после начала реакции. Низкая активность внутриклеточных протеиназ связана, возможно, с наличием специфических ингибиторов. Были проведены начальные этапы очистки ферментов методом ионообменной жидкостной хроматографии. В эксперименте использовали анионо – и катионообменники – ДЭАЭ-целлюлозу и КМ-целлюлозу, соответственно. Очистка ферментов с использованием КМ-целлюлозы не дала положительных результатов, поскольку белки не адсорбировались на носителе. В эксперименте использовали буферный раствор ацетата натрия (0,015М, рН 6,2). По-видимому, для очистки внутриклеточных протеиназ с помощью данного носителя необходимо использование буферных растворов с более высоким значением рН. При хроматографической очистке белков с помощью ДЭАЭ-целлюлозы был использован буферный раствор Tris-HCl (0,01М, рН8,0). Элюцию проводили ступенчато, методом повышения ионной силы раствора при увеличении концентрации хлорида натрия: 0,1М, 0,ЗМ, 0,5М. Были получены три пика элюции, в каждом из которых наблюдалась общая протеолитическая, а также специфическая активность. Общую протеолитическую активность определяли относительно казеина. Величина удельной специфической активности была максимальна во фракции, полученной при элюции буферным раствором, содержащим 0,3M NaCl. На электрофореграмме данной фракции, видно, что препарат фермента не гомогенен. В качестве второго этапа очистки внутриклеточных сериновых протеиназ Bacillusintermediusбыла проведена высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием колонки Mono Q – сильного анионообменника. Это позволило получить ферментный препарат с более высокой специфической протеолитической активностью.
Loading ...