BioScience Blog – Научный Биологический блог

Прорастание и рост мужского гаметофита (пыльцевых зерен и пыльцевых трубок) регулируется транспортом ионов через плазматическую мембрану [3,4]. Интерес исследователей направлен на изучение механизмов, контролирующих трансмембранную транслокацию ионов [2]. Результаты, полученные в ходе исследований в этой области, дали основание полагать, что механизмы трансдукции сигналов в пыльцевом зерне могут базироваться на транзиторных сдвигах параметров ионного гомеостаза, таких, как рН цитозоля. Целью настоящей работы было выяснение вопроса о том, способны ли фитогормоны вызывать нарушение ионного гомеостаза пыльцевых зерен петунии. Мы исходили из того, что гормон-индуцированный сдвиг внутриклеточного рН может быть вовлечен в каскад событий, обуславливающих трансдукцию гормональных сигналов в системе пыльца-пестик. В качестве индикаторов рНс использовали флуоресцеин диацетат и бис-карбоксифлуоресцеин диацетат [1]. Предварительный анализ показал, что пыльцевые зерна содержат фитогормоны, а прорастание сопровождается изменением эндогенного уровня этих соединений и чувствительно к действию экзогенных гормонов (ИУК, АБК, ГК). Пыльцевые зерна, прораставшие в присутствии фитогормонов (ИУК и АБК), претерпевали относительно быстрое защелачивание цитозоля. Гормон-индуцированный сдвиг рНс в щелочную область был полностью подавлен в присутствии ванадата. Можно предположить, что физиологическое действие фитогормонов включает в себя модуляцию рНс, то есть временное нарушение гомеостатической регуляции рН цитозоля пыльцевого зерна. Модуляция рНс может играть роль сигнала, инициируя дальнейшие ответные реакции, запускаемые фитогормонами. Полученные данные позволили заключить, что гормон-индуцированный щелочной сдвиг рНс пыльцевых зерен обусловлен активностью Н+-АТФазы плазматической мембраны и что работа этого фермента является важной частью системы регуляции рНс в пыльцевом зерне. Проведенное исследование показало, что внутриклеточный рН пыльцевых зерен чувствителен к действию фитогормонов, причем характер влияния этих соединений на рНс существенным образом зависит как от их природы, так и от физиологического состояния мужского гаметофита. Полученные данные дали основание предполагать, что гормон-индуцированный сдвиг рНс пыльцевых зерен вовлечен в каскад событий, запускающих и контролирующих процессы прогамной фазы оплодотворения с участием фитогормонов.

Читать далее…

One of the most popular ways of table olives preparing in the south of Portugal (Algarve) is the crushing them before the fermentation step. After harvesting and sorting olives are broken, washed, brined in salt solutions, and fermented at room temperature during traditional process which remains craft and empirical. The aims of this work were the characterization of traditional fermentation process of Manzanilla variety of Olea europaea fruits concerning the

Читать далее…

Современные технологии, применяемые при ликвидациях разливов нефти, несовершенны, т.к. не исключают опасности проникновения и накопления углеводородов нефти в пищевых цепях. Известно, что углеводороды являются одними из наиболее опасных, быстро распространяющихся и медленно разрушающихся соединений. Исследование процесса биодеструкции нефти актуально как в научном, так и в технологическом плане. Из микробиоты Балтийского моря были выделены ассоциации углеводородокисляющих бактерий. Входящие в их состав аэробные бактерии были идентифицированы как относящиеся к родам Alteromonas, Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, CytophagaMicrococcus, Myxococcus, Nocardia, Рseudomonas, Rhodococcusи Spirillum. Стояла задача определения последовательности и порядка биоразложения компонентов нефти и выделения доминирующих на каждой стадии аэробных бактерий. Выделение штаммов бактерий проводили, используя плотную минеральную среду Чапека с нефтью (малопарафинистая маловязкая лёгкая Западносибирская), фракциями нефти (керосин, дизель) или индивидуальными углеводородами (пента-, до – и гексадекан). Остаточные углеводороды выделяли экстракцией из культуры бактерий на разных стадиях окисления углеводородов и анализировали методами газовой и жидкостной хроматографии. Было установлено, что за 7 суток эффективность очистки морской воды от нефти в лабораторных условиях составила более 70 %. В процессе биодеструкции состав нефти претерпел существенные изменения. При этом все определяемые группы углеводородов нефти, а именно парафино-нафтеновые, моно-, би – и полициклические ароматические углеводороды, смолы и асфальтены, подвергались биодеструкции. Наибольшая степень биодеградации отмечена для полициклических ароматических углеводородов, смол и асфальтенов, в то время как в работах других исследователей сообщается, что степень биоразрушения обычно наиболее высока для алканов. В процессе исследования была обнаружена способность сменяющих друг друга в процессе сукцессии штаммов – компонентов природной ассоциации – к синтезу внеклеточных полисахаридов и/или ПАВ. Экзополисахариды, образуемые первичным консументом сообщества, характеризующимся гидрофобной клеточной стенкой, выполняют в ассоциации функции межклеточного матрикса, способствующего иммобилизации бактерий и обеспечивающего накопление и обмен метаболитами между различными штаммами. Био-ПАВ, выделяемые вторичным и третичным консументом, обладающим гидрофильной клеточной стенкой, осуществляют эмульгирование первично-окисленных углеводородов и дальнейшее их расщепление. Помимо экологических функций, синтезируемые исследованными бактериями нефтеокислителями экзополисахариды и ПАВ могут найти применение в технологиях нефтедобычи.

Одной из актуальных проблем физиологии растений является выяснение механизмов трансдукции гормональных сигналов. В последние годы установлено участие свободных радикалов, таких как разные формы оксида азота (NO· и NO+) в передаче сигналов у эукариот и прокариот. В частности, было показано [1,2], что оксид азота (NO) способен имитировать эффекты ауксина на деление и растяжение клеток, ризогенез. Однако оставалось неясным, участвует ли оксид азота в трансдукции ауксинового сигнала или действует вне этого процесса. Нами было показано, что ауксин вызывал быстрое образование оксида азота в 3-4 дневных проростках арабидопсиса, что позволило предположить прямое влияние ауксина на NO-генерирующие ферменты. Было изучено влияние разных форм оксида азота на экспрессию in planta ауксин-зависимой генетической конструкции Dr5::GUS, которая была создана на основе промотора гена первичного ответа на ауксин. Дополнительным объектом исследования являлась NO-зависимая генетическая конструкция Atfer1::GUS, которая была создана на основе промотора гена первичного ответа на оксид азота Atfer1. Опыты проводили на 3-4-дневных проростках трансгенного арабидопсиса, при короткой (4 ч) экспозиции. Индукторы и ингибиторы вносили в раствор, в котором инкубировали проростки. Влияние на экспрессию данных генетических конструкций определяли количественно по активности GUS in vitro флуорометрическим методом. Показано, что NO-доноры нитрозониум катион (NO+) и радикальной формы оксида азота (NO·) нитропруссид натрия (SNP), нитрозоцистеин, нитрозоглутатион, динитрозильное производное DTT (DTT(NO)2) и NOR-3 усиливали экспрессию ауксин-зависимой генетической конструкции Dr5::GUS в зависимости от соединения 1,3-4 раза. Для повышения проницаемости использовали Triton X100 в концентрации 0,1%, что привело к усилению эффекта нитрозотиолов, в особенности короткоживущего донора оксида азота DTT(NO)2, активность которого возросла в 3,6-4 раза. Донор нитроксил аниона (NO-) мононитрозильное производное DTT (DTT-NO) ингибировал эффект ауксина на 65%, этот эффект снимался SNP. Конкурентный ингибитор NO-синтазы L-NNA и скевенджеры (поглотители) оксида азота: сРТЮ и гидроксикобаламин, – подавляли эффект ауксина на экспрессию Dr5::GUS на 83% и 56%, соответственно. Эти эффекты ингибирования в разной степени снимались с помощью SNP. Ауксин в свою очередь усиливал экспрессию NO-зависимого промотора Atfer1 в 2,7-6 раз. Ингибитор NO-синтазы L-NNA подавлял этот эффект ауксина. На основе полученных данных можно предполагать участие отдельных форм NO во внутриклеточной трансдукции ауксинового сигнала.

Читать далее…

Циклодекстрины (ЦД) нашли широкое применение в косметической, фармакологической и пищевой отраслях промышленности, а также в сельском хозяйстве. В пищевой промышленности благодаря использованию комплексов включений биологически активных веществ (БАВ) с ЦД удается улучшить потребительское качество продуктов: пищевую и биологическую ценность, органолептические показатели, а также стабилизировать пищевые эмульсии и пены. Гомологический ряд ЦД включает в себя а, Р, и у-ЦД, состоящие соответственно из 6,7 и 8 остатков глюкозы в цикле. На кафедре «Биотехнология» МГУПП ранее были разработаны биотехнологии а и Р-ЦД и комплексов включения с витаминами и ароматическими веществами на их основе. у-ЦД отличается от а – и Р-ЦД размерами внутримолекулярной полости. В связи с этим, они способны образовывать комплексы включения с более крупными молекулами. Объектами исследования для скрининга микроорганизмов-продуцентов у-специфичных циклодекстринглюканотрансфераз (у-ЦГТаз – фермента, катализирующего биосинтез у-ЦД) являлись коллекционные культуры МГУПП и природные источники. В качестве коллекционных культур использовали: Bacillusmacerans, В. circulans, В. megaterium, В. insectus. В качестве природных источников изолятов бактерий использовали образцы почв: Московской, Волгоградской, Воронежской, Тамбовской, Тульской областей, а также образцы почв, привезенные из республики Саха (Якутия), образцы соломы, травы и семена злаковых культур: кукурузы, овса и ячменя. В результате исследований был выделен штамм-продуцент у-ЦГТ-азы Bacillussp. 35н. Для культивирования в лабораторных условиях первоначально была выбрана питательная среда следующего состава (в %): растворимый крахмал – 1, пептон – 0,3, дрожжевой экстракт – 0,3, ку курузный экстракт – 0,3, СаСОз – 0,5. При исследовании динамики биосинтеза у-ЦГТ-азы штаммом Bacillussp. 35н на выбранной питательной среде было установлено, что максимум ферментативной активности культуры при температуре 30°С приходится на вторые сутки и составляет 17,3 ед/см3. В дальнейшем на основании выявленной зависимости биосинтеза у-ЦГТ-азы штаммом Bacillussp. 35н от природы источников углерода, азота и фосфора была проведена оптимизация состава питательной среды. Состав оптимизированной питательной среды (в %): нерастворимый крахмал – 1,0, КН2РО4 – 0,2, пептон – 0,3, дрожжевой экстракт – 0,5, декстрины – 1,0, СаСОз – 0,5, MgSO4 – 0,01. Использование этой среды способствовало увеличению активности у-ЦГТазы на 40%. Были подобраны оптимальные условия осаждения у-ЦГТ-азы: соотношение объемов 96% этанола и культуральной жидкости 3,5:1, рН 6,0 и температура 3°С. Высушенный при 40°С ферментный препарат имел активность у-ЦГТ-азы 2020 ед/г.

Суспензионная культура растительных клеток является удобной модельной системой для изучения различных физиологических процессов, происходящих на клеточном уровне. Важнейшим процессом, обеспечивающим энергетические потребности клетки, является дыхание. В то же время, особенности процесса дыхания в клетках in vitro изучены недостаточно. В частности, практически не известно соотношение интенсивности общего и цианидрезистентного (альтернативного) дыхания в разные фазы роста культуры, а также влияние особенностей процесса дыхания клеток на биосинтетические способности клеток (в том числе синтеза вторичных метаболитов). Одной из наиболее интересных культур клеток – продуцентов вторичных метаболитов является Dioscorea deltoidea W. Клетки этой культуры синтезируют фуростаноловые гликозиды, содержание которых в высушенной биомассе достигает 10%. В качестве объекта исследования использовали мутантный штамм ДМ-0,5, полученный в Отделе биологии и биотехнологии ИФР РАН. Культивирование проводили в колбах на качалке по стандартной методике на жидкой среде Мурасиге-Скуга, с добавлением витаминов по Стаба, 2,4-D и кинетина. Для характеристики роста и физиологического состояния культуры использовали сырую и сухую массу клеток, их концентрацию в суспензии и жизнеспособность. В процессе выращивания проводили количественное определение фуростаноловых гликозидов спектрофотометрическим методом. Общую скорость дыхания и вклад различных его путей в общее поглощение кислорода на разных стадиях культивирования проводили на полярографической установке, используя ингибиторный анализ. В результате проведенных экспериментов были получены характерные S-образные кривые роста по всем исследуемым параметрам. Максимальная удельная скорость роста в экспоненциальной фазе достигала 0,393 к концу цикла накопление биомассы по сухому весу достигало 9,31, показатели жизнеспособности культуры колебались от 87% в начале цикла до 65% в конце цикла. Содержание фурастоноловых гликозидов к концу цикла составляло 6-8% к сухой массе клеток. Максимальная интенсивность дыхания наблюдалась на стадии экспоненциального роста (856,9±81,6 мгО2/ч*гсыр.массы). На стадии замедления роста и отмирания клеток наблюдалось снижение общей интенсивности дыхания (697,9±66,5 мгО2/ч*гсыр.массы) на фоне увеличения вклада остаточного дыхания в общее поглощение кислорода, что коррелирует с общим снижением всех ростовых и биосинтетических характеристик (жизнеспособность, сырой и сухой вес).

Внеклеточная эндонуклеаза (К.Ф. 3.1.30.2) грамотрицательных бактерий S. marcescens(Sma nuc) является наиболее изученным ферментом в ряду бактериальных нуклеаз с широкой специфичностью. Несмотря на значительный прогресс в исследовании эндонуклеазы, сведений о механизмах регуляции биосинтеза данного фермента недостаточно. Известно, что секреция нуклеазы в окружающую среду обычно происходит в стационарной фазе роста бактерий. Биосинтез эндонуклеазы увеличивается при SOS – ответе клеток на повреждение ДНК и блокирование ее репликации. При ингибировании биосинтеза пуринов происходит угнетение роста бактерий и смещение пика активности внеклеточной эндонуклеазы из стационарной фазы в экспоненциальную. Кроме этого секреция эндонуклеазы в окружающую среду происходит сразу же в ответ на блокирование. Вместе с тем данных о биосинтезе эндонуклеазы в ответ на блокирование биосинтеза пуринов нет. Для исследования биосинтеза эндонуклеазы в ответ на блокирование биосинтеза пуринов мы анализировали динамику роста микробной популяции и секреции внутриклеточной (в периплазму) и внеклеточной (в культуральную жидкость) эндонуклеазы S.marcescensW1050 в присутствии и в отсутствие 0,1% 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола (2ПАБСТ). Показано, что в присутствии 0,1% 2ПАБСТ происходило подавление роста микробной популяции в целом. Продолжительность адаптационной и экспоненциальной фаз увеличивалась в 2-3 раза. Максимальное накопление внеклеточной эндонуклеазы наблюдали в конце экспоненциальной, а внутриклеточной – в конце стационарной фазы, что отличалось от динамики накопления фермента в отсутствие 2ПАБСТ, когда максимальное накопление внутри – и внеклеточной эндонуклеазы наблюдали в середине стационарной фазы роста и развития микробной популяции. Отличительной особенностью биосинтеза эндонуклеазы в условиях блокирования пуринов служило повышение уровня внеклеточного фермента в адаптационной фазе, то есть вслед за добавлением 2ПАБСТ. Сравнительный анализ показал, что блокирование биосинтеза пуринов сочеталось с увеличением биосинтез эндонуклеазы. За 36 часов роста и развития микробной популяции в присутствии 2ПАБСТ было синтезировано примерно в 1,6 раза больше эндонуклеазы, чем в отсутствие 2ПАБСТ. Соответственно возрастала и продуктивность культуры по эндонуклеазе, примерно 2,7 раза. Таким образом, показано, что в результате подавления биосинтеза пуринов с помощью 2-ПАБСТ происходит качественное и количественное изменение динамики роста и развития S. marcescensW1050, сопряженное с увеличением биосинтеза и продукции фермента, а также с перераспределением эндонуклеазы между периплазмой и культуральной средой.

Ковалентные соединения вирусных геномов с терминальными белками широко представлены в природе: у пикорнавирусов, потивирусов, бактериофагов, аденовирусов и др. к 5′-концу РНК или ДНК ковалентно присоединен белок, играющий важную роль в инициации репликации вирусного генома. Есть основания считать, что подобные по структуре соединения образуются и в неинфицированной клетке. Для изучения инициации репликации подобных вирусных геномов и поиска новых клеточных комплексов нуклеиновых кислот с белками необходима разработка новых инструментов, позволяющих специфически определять ковалентные соединения нуклеиновых кислот и белков. Одним из инструментов для определения ковалентных соединений этого типа являются антитела к узловой структуре фосфодиэфирной связи между нуклеиновой кислотой и белком.

Читать далее…