Клеточные микротрубочки (МТ) характеризуются уникальным свойством – динамической нестабильностью – их плюс-концы, обращенные к периферии клетки, постоянно находятся в состоянии случайно чередующихся фаз роста-укорочения и пауз. Для объяснения биологической целесообразности этого феномена была предложена модель «поиска и захвата»: во время событий роста и укорочения, плюс-концы МТ получают возможность «нащупать» в пространстве клетки мишени, подлежащие активному транспорту вдоль МТ, или мишени, движение которых, непосредственно связано с динамикой плюс-концов МТ. Классическим и хорошо изученным примером «поиска и захвата» является взаимодействие плюс-концов МТ с кинетохорами хромосом в митотических клетках, однако эпизоды «поиска и захвата», а также механизмы их обеспечивающие, в интерфазных клетках изучены значительно хуже. В настоящей работе мы попытались выяснить вопрос о необходимости «поиска и захвата» при взаимодействии динамичных МТ с мембранными органеллами, которые должны быть транспортированы в направлении минус-конца МТ посредством цитоплазматического динеина. В качестве клеточной модели для наших экспериментов, мы использовали культивируемые меланофоры Xenopuslaevis, цитоплазма которых обогащена пигментными гранулами (ПГ) – мембранными пузырьками, наполненными черным пигментом, меланином. В ответ на различные внеклеточные стимулы, меланофоры способны быстро перераспределять свои ПГ в объеме цитоплазмы, за счет работы молекулярных моторов, транспортирующих ПГ по цитоскелетным трекам. Видеонаблюдения за совместным поведением индивидуальных МТ и ПГ в меланофорах, в которых был искусственно активирован динеин-зависимый транспорт, позволили зарегистрировать взаимодействия между плюс концом МТ и ПГ. МТ подрастала к неподвижной ПГ, контактировала с ней своим плюс-концом, в результате такого контакта ПГ оказывалась заякоренной на МТ и приступала к перемещению в направлении минус-конца МТ. Ингибирование же динамики МТ с помощью таксола в низких концентрациях, исключало такие взаимодействия и резко снижало эффективность минус-концевого транспорта ПГ. Каковы же молекулярные механизмы взаимодействия плюс-концов МТ с ПГ? Наиболее вероятными кандидатами на роль «коннекторов» между плюс-концом МТ и ПГ, являются белки, специфически связывающиеся с плюс-концами микротрубочек (+TIPs). Попеременное блокирование функций основных белков этой группы (EB1, p150Glued, CLIP-170, Lis1), позволило нам выявить роль CLIP-170, который был впервые открыт как белок, связывающий микротрубочки с мембранами (Cytoplasmic Linker Protein, 170K). Мы показали, что диссоциация эндогенного CLIP-170 с плюс-концов МТ на фоне эктопической экспрессии доминантно-негативной формы белка исключает взаимодейсвия растущих концов МТ с ПГ и ингибирует их динеин-зависимый транспорт. Более того, CLIP-170 биохимически обнаруживается в составе ПГ, выделенных из меланофоров. Известно, что благодаря N-концевому домену CLIP-170 взаимодействует с плюс-концами МТ, а его С-концевой домен экспонирует множественные участки для белок-белковых взаимодействий. Вероятно, именно благодаря С-концевому домену ассоциированный с МТ CLIP-170 устанавливает связь с ПГ. Таким образом, наши данные свидетельствуют о необходимости механизма «поиска и захвата» для инициации динеин-зависимого транспорта мембранных органелл.
Loading ...