BioScience Blog – Научный Биологический блог

Определяли мутации в митохондриальной ДНК (мтДНК) тканей головного мозга и селезенки, а также в циркулирующей мтДНК плазмы крови мышей, подвергнутых радиационному воздействию. Анализы проводили через 8, 14, 28 дней после рентгеновского облучения всего их тела в дозе 5 Гр. Количество мутаций оценивали по результатам расщепления CEL I эндонуклеазой (специфически разрезающей ДНК по участкам с неспаренными основаниями) гетеродуплексов, полученных гибридизацией продуктов ПЦР мтДНК (фрагменты гена ND3 и двух участков D-loop разного размера) из тканей облученных и контрольных мышей. Анализ мутаций этим методом включает 4 стадии: (1) PCR-амплификация участка ДНК от облученных (О) и контрольных (К) мышей; (2) получение гетеродуплексов гибридизацией продуктов PCR О-ДНК и К-ДНК; (3) обработка гетеродуплексов CEL I нуклеазой; и (4) электрофоретический анализ продуктов расщепления CEL I нуклеазой. Результаты показывают, что в тканях мозга и селезенки наибольший уровень мутантных копий мтДНК (по двум участкам D-loop и гену ND3) наблюдается на 8 день после облучения. Анализы мутаций в мтДНК тканей мышей, в последующие дни после облучения, показали постепенное снижение их уровня к 28 дню. Снижение количества участков, разрезаемых CEL I нуклеазой, в мтДНК, полученной из селезенки, значительно более резкое по сравнению с мтДНК, полученной из головного мозга. К тому же, по сравнению с тканями контрольных мышей в течение с 8 по 28 дней после облучения на 30-40% снижается и общее количество копий мтДНК. К этим 8, 14 и 28 дням пострадиационного периода доля мутантных копий в циркулирующей мтДНК (по участку D-loop и гену ND3) плазмы крови в два раза выше, чем таковой в мтДНК тканей. Максимально высокий процент мутантных копий циркулирующей мтДНК плазмы и повышение ее общего содержания регистрируется на 14 день после облучения. Результаты исследования позволяют полагать, что из тканей облученных животных в пострадиационный период элиминируются мутантные копии мтДНК. Фрагменты крупного размера мутантной и нормальной (дикой) мтДНК переходят в кровоток облученных животных. Наблюдаемое увеличение количества циркулирующей мтДНК и ее мутантных форм в плазме крови облученных животных может указывать на степень их радиационного поражения. Полученные результаты позволяют также предполагать, что повышенное содержание мутантных копий мтДНК в плазме крови могут служить чувствительным маркером для оценки радиационного поражения и иных генотоксических воздействии на организм.