BioScience Blog – Научный Биологический блог

В настоящее время весьма актуальной представляется проблема изучения молекулярных основ патогенеза токсического гепатита. Классическим гепатотропным агентом, индуктором свободнорадикального окисления в гепатоцитах является ССl4 [1]. Важную роль в системе антиоксидантной защиты (АОЗ) организма отводят глутатионпероксидазной / глутатионредуктазной (ГР/ГП) системе. ГР катализирует реакцию восстановления окисленного глутатиона в его восстановленную форму, используя в качестве донора водорода НАДФН [2].

Вместе с тем, одной из перспективных задач биохимии является поиск эффективных веществ-антиоксидантов, введение которых при патологии может оказывать положительное действие. К числу таких соединений могут быть отнесены тиоктовая кислота (ТК) и восстановленный глутатион (GSH), но их влияние на регуляцию активности ферментов АОЗ, и в частности ГР, остаются не исследованными.

Цель настоящей работы — изучение влияния малата, 2-оксоглутарата и оксалоацетата на активность ГР при введении ТК и GSH при развитии патологии.

Объектом исследования служили самцы белых лабораторных крыс массой 150-200 г. Экспериментальный токсический гепатит (ЭТГ) у животных вызывали путем перорального введения СCl4 в виде раствора в вазелиновом масле в дозе 0,064 мл на 100 г веса животного после суточной пищевой депривации; ТК животным вводили в дозе 35 мг/кг [3] в течение 4-х дней внутрибрюшинно после индуцирования ЭТГ; GSH вводили внутрибрюшинно в дозе 150 мг/кг [4] на фоне развития патологии также в течение 4-х дней эксперимента. На четвертые сутки печень крысы, подвергнутой токсическому гепатиту, извлекали под наркозом после многократного перфузирования ледяным физиологическим раствором и использовали для дальнейших исследований. Активность ГР определяли спектрофотометрически при 340 нм. Активность фермента выражали в виде удельной активности. Процедура очистки ГР из печени крысы включала несколько стадий: фракционирование белков сульфатом аммония в пределах насыщения 40-70%, гель-фильтрацию на сефадексе G-25, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, концентрирование с помощью ячейки «Amicon», хроматографию на колонке с Тойоперл HW-65. На гомогенных препаратах ГР из печени крыс с токсическим гепатитом, которым вводили

ТК и GSH, были изучены регуляторные свойства фермента под действием некоторых органических кислот.

При исследовании влияния малата и 2-оксоглутаратана на активность ГР из печени крыс, которым вводили GSH на фоне развития патологии показано, что при концентрации интермедиатов до 0,1 мМ имеет место снижение ГР-активности. Но при дальнейшем повышении концентрации метаболитов скорость протекания ферментативной реакции возрастает и при 0,3 мМ концентрации наблюдается максимальный активирующий эффект. При концентрациях метаболитов выше 0,5 мМ активность фермента вновь снижается. При введении ТК на фоне токсического гепатита малат оказывает сходное влияние. Однако 2-оксоглутарат выступает как ингибитор ферментативной активности во всем диапазоне исследуемых концентраций. Константа ингибирования составила 0,5мМ, показан неконкурентный тип ингибирования.

При исследовании влияния оксалоацетата на активность ГР было выявлено, что при низких концентрациях данный метаболит вызывает ингибирование скорости ферментативной реакции во всех условиях эксперимента. При концентрации интермедиата свыше 0,45 мМ наблюдается активация ГР из печени крыс, которым вводили GSH при токсическом гепатите более чем на 20%, в то время как для фермента из пораженной гепатотоксином печени при введении ТК имеет место дальнейшее усиление ингибирующего действия. Так, при 1,2 мМ концентрации интермедиата активность фермента снижалась более чем на 30%.

Таким образом, в результате проведенных исследований выявлено, что в регуляции активности ГР при введении ТК и GSH при ЭТГ могут принимать участие некоторые метаболиты цикла трикарбоновых кислот.

Литература

1.                                                                                Sun F. et al.
Evaluation of oxidative stress during apoptosis and necrosis caused by carbon tetrachloride in rat liver // Biochim. Biophys. Acta. – 2001.-V. 1535,№2.-P.186-191.

2.                                                                              Карпищенко А.С. Медицинская технология и лабораторная диагностика.   Справочник  в  2т.   Т.1.  Медицинские  и  лабораторные технологии // СПб: Интермедика, 1999. – 650 с.

3.                                                                             Бустаманте Дж. И др. Метаболизм α-липоевой кислоты в печени при различных формах патологии // Междунар. мед. журн. — 2001. — №2.-С. 133-141.

4.                                                                             Девяткина Т.А. и др. Особенности процессов перекисного окисления липидов в различных тканях при остром стрессе и его коррекции пирацетамом, и церебролизином // Биохимия. – 2000. – Т. 4. – С. 38-41.