BioScience Blog – Научный Биологический блог

Изо форма тропонина I из сердца человека (hcTnl) представляет собой надежный маркер повреждения кардиомиоцитов, сопровождающего такие серьезные сердечно­сосудистые заболевания, как инфаркт миокарда. Моноклональные антитела 19С7, полученные гибридомным методом, с высокой аффинностью распознают hcTnl и используются в современных диагностических системах для количественного определения концентрации hcTnl в крови. Таким образом, создание новых и усовершенствование уже существующих диагностических систем такого типа представляет собой актуальную задачу как с фундаментально научной, так и с прикладной биомедицинской точек зрения. Одним из возможных способов модификации диагностических систем является использование рекомбинантных аналогов антител, входящих в их состав. Существенным преимуществом рекомбинантных антител перед антителами, полученными стандартным гибридомным методом, является возможность модификаций их последовательности с помощью генно-инженерных методов. Это позволяет изменять такие свойства антител, как аминокислотный состав, аффинность, состав доменов, молекулярный вес, а также сорбционные свойства. Наиболее широко используемыми в диагностических системах рекомбинантными фрагментами антител, сохраняющими все свойства полноразмерных молекул, являются Fab-фрагменты. Таким образом, целью настоящей работы было получение рекомбинантных Fab-фрагментов антител клона 19С7 и изучение их биохимических и иммунохимических свойств.

кДНК Fd фрагмента тяжелой (фТЦ) и легкой цепи (ЛЦ) антител 19С7 со свободным цистеином в С-концевой части, были получены методами обратной транскрипции мРНК, выделенной из клеток гибридомы 19С7, и последующей ПЦР реакции со специфическими праймерами. Полученные фрагменты были встроены в вектор рЕТ23а+ по сайтам рестрикции Hindlll и Xhol для независимой экспрессии в клетках штамма BL21pLysS E. coli. ЛЦ и фТЦ антител клона 19С7 были экспрессированы в клетках штамма BL21pLysS E. coliи идентифицированы методами электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия и иммуноблоттинга с использованием специфических антител к Fab-фрагментам. Для образования дисульфидных связей фТЦ и ЛЦ, выделенные из телец включения, были подвергнуты ренатурации, а фракция иммунохимически активных Fab-фрагментов затем была аффинно-очищена на носителе Sulfolink с иммобилизованным пептидом, идентичным эпитопу антител 19С7. Чистота полученного препарата рекомбинантных Fab-фрагментов составила 80%. С помощью иммуноферментного анализа было показано, что полученные рекомбинантные Fab-фрагменты антител клона 19С7 взаимодействуют с hcTnl и тропониновым комплексом с высокой чувствительностью, сравнимой с чувствительностью антител 19С7, полученных гибридомным методом.

Таким образом, в результате нашей работы был получен препарат рекомбинантных Fab-фрагментов антител клона 19С7, которые обладают иммунохимической активностью, сравнимой с активностью антител клона 19С7, полученных гибридомным методом.