BioScience Blog – Научный Биологический блог

Волкова О.В., Кошелева И.А.

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов, Пущино (Россия), Пущинский государственный университет, Пущино (Россия). E-mail: volkova_o_v@inbox.ru

Известно, что генетические системы, контролирующие биодеградацию нафталина и некоторых других ПАУ псевдомонадами, в большинстве случаев локализованы на крупных коньюгативных плазмидах, относящихся к Р-2, Р-7 и Р-9 группам несовместимости. Принадлежность плазмиды к той или иной группе несовместимости, круг бактериальных хозяев, а следовательно и судьба генов биодеградации в конкретных микрокосмах определяется в основном свойствами ее базового репликона. К настоящему моменту достаточно детально разработана классификация плазмид Inc P-9 группы, в то время как о плазмидах Р-7 группы доступна лишь скудная информация.

Для облегчения изучения генетических детерминант поддержания Inc P-7 плазмид целесообразно получение базовых репликонов, включающих минимальный набор участков ДНК и генов, обеспечивающих независимую репликацию и стабильное поддержание плазмиды. Для получения таких репликонов была избрана стратегия лигирования Hind III – или Sau 3A-рестриктов плазмид Inc P-7 группы с кассетами, детерминирующими устойчивость к тетрациклину или гентамицину, выщепленными из p34S-Tc или p34S-Gm, соответственно. Полученные конструкты с помощью электропорации вводились в штаммы PseudomonasputidaKT2442 (gfp, KmR) и BS394 (Cys-). Данным способом были получены клоны P. putidaBS394, устойчивые к тетрациклину и содержащие фрагмент (примерно 7 kb) плазмиды биодеградации нафталина pFME5 (80 kb, выделена из P. fluorescensFME5 ), способный к автономной репликации и стабильному поддержанию в данном хозяине.

На основе анализа известных нуклеотидных последовательностей базовых репликонов Inc P-7 группы были разработаны несколько пар праймеров, позволивших подтвердить наличие характерных участков ДНК в полученном репликоне (pFME5mini): repA, ori, parC и parA. Секвенирование pFME5mini с дальнейшим делеционным анализом позволит детально изучить генетический контроль поддержания pFME5 в различных бактериальных хозяевах, а совместно с исследованием подобных генетических кластеров других Inc P-7 плазмид – создать основы для системы классификации плазмид данной группы несовместимости.