BioScience Blog – Научный Биологический блог

Адаптерные белки семейства She, одним из представителей которого является p66Shc, вовлечены в передачу сигнала от тирозинкиназных рецепторов внутрь клетки. При этом они регулируют активность факторов, ответственных за запуск Ras и МАР-киназного каскада, что выражается в изменении пролиферативной активности клетки. В частности, белок p66Shc ингибирует последнюю. В отличие от других представителей семейства, p66Shc имеет еще одну функцию: способность индуцировать митохондриальный апоптоз (р53-зависимый), вызванный окислительным стрессом, непосредственно участвуя в генерации АФК в клетке. Поэтому представляется интересным исследование роли белка p66Shc в процессах старения, канцерогенеза и влияния его на продолжительность жизни как отдельных клеток, так и индивидуальных организмов. Для дальнейших более детальных исследований функций белка p66Shc представляется актуальным разработка системы экспрессии и очистки белка p66Shc для получения его в препаративных количествах. Ранее нами была получена экспрессионная конструкция на основе плазмидного вектора рЕТ-32а, в которой ген человеческого p66Shc в слиянии с геном тиреодоксина (TRX) находился под контролем промотера фага Т7, индуцируемого ИПТГ. Для последующей очистки и расщепления слитного белка TRX-p66Shc в конструкции непосредственно перед 5′-концом гена p66Shc имелись две последовательности, кодирующие 6 остатков His и сайт расщепления легкой цепи энтеропептидазы человека (L-HEP) соответственно. Была проведена оптимизация условий гибридной экспрессии в данной конструкции. В настоящей работе осуществлены наработка TRX-p66 Shc и очистка его с помощью металл-хелатной хроматографии на сорбенте Ni-NTA-агароза (Qiagen, США), подобраны условия расщепления слитного белка протеазой L-HEP. Однако в ходе электрофоретического анализа продуктов расщепления не было обнаружено белка с молекулярным весом, рассчитанным для p66Shc (62 кДа). В то же время среди них присутствовали продукты с кажущимся молекулярным весом в 30 и 40 кДа. Анализ их JV-концевых последовательностей позволил установить наличие в аминокислотной последовательности p66Shc неспецифического сайта (DR), по которому также осуществляется расщепление L-HEP, что приводит к невозможности получения нативного целевого белка. В связи с этим ген p66Shc был переклонирован в новую экспрессионную конструкцию, аналогичную предыдущей, но содержащую последовательность, которая кодирует сайт расщепления протеазой «фактор Ха» вместо L-HEP. Эту систему экспрессии гибридного белка оптимизировали по трем параметрам: а) температура инкубации клеточной культуры; б) время инкубации; в) концентрация индуктора экспрессии ИГПТ. Затем была предложена предварительная схема очистки TRX-p66Shc, включающая в себя комбинацию металл-хелатной (Ni-NTA-агароза) и анионообменной хроматографии (Macro Prep High Q, Bio-Rad, США); подобраны условия расщепления слитного белка «фактором Ха» и очистки целевого p66Shc на Ni-NTA-агарозе.