BioScience Blog – Научный Биологический блог

Поверхностно-активные вещества, образуемые микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности и входящие в состав их клеточной стенки, в последние годы привлекают пристальное внимание как потенциальные агенты медицины. Повышенный интерес обусловлен их уникальной структурой и свойствами, а также возрастающей потребностью фармакологической промышленности в препаратах многоцелевого назначения, обладающих одновременно иммуномодулирующей, противоопухолевой          и          противомикробной активностью.

Иммуномодулирующая активность микробных биосурфактантов обусловлена наличием в их структуре миколовых кислот. Повышенным содержанием миколовых кислот характеризуются клетки коринеформных и нокардиоформных актинобактерий, однако иммунологическая активность их гликолипидов проявляется чаще всего в цитотоксическом действии из-за явной или потенциальной опасности штаммов-продуцентов и, следовательно, высокой токсичности азуемыхобр ими комплексов. В этой связи актуален поиск продуцентов гликолипидных биосурфактантов среди представителей непатогенных актинобактерий.

Известно, что при попадании в организм гликолипиды клеточной стенки бактерий взаимодействуют главным образом с Toll-подобными рецепторами (TLR-2, TLR-4), экспрессированными большей частью на клетках миеломоноцитарного ряда, и активируют в них каскад реакций, сопровождающийся в первую очередь секрецией цитокинов провоспалительной группы. Ранее нами был получен препарат гликолипидной природы, синтезируемый штаммом Rhodococcus ruber ИЭГМ 231, проанализирована его химическая структура и сурфактантная активность [1, 2], показана способность стимулировать пролиферативный ответ лимфоцитов в системе in vitro [3].

Цель настоящей работы — исследование влияния биологически активного гликолипидного биосурфактантного комплекса (ГЛБ) из R. ruber ИЭГМ 231 на секрецию про – и противовоспалительных цитокинов моноцитами периферической крови.

Объектом исследования служила периферическая кровь доноров-добровольцев в возрасте 18-35 лет. Фракцию мононуклеаров получали путем центрифугирования плазмы периферической крови в градиенте плотности фиколл-урографин (ρ= 1,077), затем часть суспензии мононуклеаров использовали для получения фракции моноцитов, которую выделяли механическим способом на чашках Петри. Полученные клеточные суспензии дважды отмывали, выдерживали в течение 1 ч при 4оС с целью снятия активации, вызванной выделением, и культивировали в течение 24 ч в среде RPMI 1640 (ICN) с добавлением 10 mM HEPES (Sigma), 2 mM L-глутамина (Sigma), 100 мкг/мл гентамицина и 10% ЭТС (ICN). Каждая культура содержала 106 клеток/мл. ГЛБ, продуцируемый штаммом R. ruber ИЭГМ 231 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов вносили в культуры в концентрациях 100, 10, 1, 0,1 мкг/мл. Рабочие концентрации препарата готовили в физиологическом растворе либо питательной среде 199 в виде эмульсии "вода/масло" посредством ультразвуковой (23 кГц, 30 сек) обработки. Супернатанты клеточных культур хранили в замороженном состоянии при – 20°С. Определение нцентрациико провоспалительных цитокинов IL-1β, TNF-α, IL-6, р 70 субъединицы IL-12, IL-18, а также IL-10 – ключевого противовоспалительного цитокина в супернатантах клеточных культур проводили с использованием наборов "BenderMedsystems", "Biosourse" (ГК «Биохиммаг», Москва) и ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) в соответствии с методикой, предложенной производителем.

Статистический анализ осуществляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа и t-критерия Фишера наименьшей значимой разницы; парного t-критерия Стъюдента. Данные на рисунках представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки.

Результаты исслдеования влияния биосурфактантного гликолипидного комплекса на продукцию цитокинов IL-1β, TNF-α, IL-6 во фракции моноцитов и мононуклеаров представлены на рис. 1. Показано, что исследуемый препарат в концентрации 10 мкг/мл стимулировал выделение TNF-α моноцитами спустя 24 часа от начала культивирования. Менее выраженный, но статистически значимый стимулирующий эффект препарата на продукцию IL-1β зарегистрирован в супернатантах 24-часовых культур моноцитов. При этом не выявлено влияния препарата на продукцию моноцитами IL-6.

Во фракции мононуклеаров при добавлении препарата выявляется тенденция к увеличению уровня TNF-α в 24-часовых культурах, однако статистически значимого стимулирующего эффекта ГЛБ на продукцию TNF-α, IL-1β-6в и IL в культурах, содержащих одновременно моноциты и лимфоциты, не зарегистрировано.

В результате следующей серии экспериментов показано, что ГЛБ в концентрациях 10 и 1 мкг/мл стимулирует выделение IL-12 моноцитами спустя сутки от начала культивирования. Внесение в культуры ГЛБ не изменяет уровни – 10 и IL-18, секретируемых моноцитами. Иная картина наблюдалется при анализе цитокинпродуцирующей функции системы «моноциты + лимфоциты». Во фракции мононуклеаров не отмечается статистически значимых эффектов биосурфактанта на продукцию IL-10 и IL-12, при этом продукция IL-18 значительно усиливается при добавлении в культуры ГЛБ в концентрации 100 мкг/мл (рис. 2).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемый гликолипидный биосурфактант индуцирует продукцию моноцитами провоспалительных цитокинов IL-1β, TNF-α, IL-12. Пприсутствие лимфоцитов в среде культивирования является решающим фактором для «переключения» моноцитов на продукцию IL-18 под влиянием данного препарата.

Литература

1.                                                                              Kuyukina M.S. et al   ecovery of .RRhodococcus
biosurfactants using methyl-tertiary butyl ether extraction // J. Microbiol. Methods. — 2001. — V. 46. — P. 149-156.

2.                                                                              Philp J.C. et al. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2002. – V. 59. – P. 318-324.

3.                                                                              Куюкина М.С. и др. In vitro иммуномодулирующая активность биосурфактантного гликолипидного комплекса из Rhodococcus ruber // Бюлл. эксп. биол. мед. – 2007. – Т. 144, № 9. – С. 301-305.