BioScience Blog – Научный Биологический блог

Расшифровка протеома эукариотической клетки в настоящий момент представляет собой практически неразрешимую задачу из-за сложности белкового состава. В связи с этим митохондрии являются идеальным объектом для протеомного анализа, так как имеют не слишком высокий уровень белковой организации. При этом митохондрии играют важную роль в жизнедеятельности клеток и целого организма. Известно, что митохондриальные дисфункции, связанные с дефектами митохондриальных белков, приводят к развитию более 40 различных заболеваний человека. В данной работе в качестве объекта исследования были выбраны митохондрии сердца Bostaurus.

С целью упрощения белкового состава анализируемого объекта был разработан метод выделения митохондриальных компартментов в качестве индивидуальных фракций. Данное сообщение посвящено анализу белков фракции внутренних мембран митохондрий. Для этого использовали сочетание различных методов расщепления белковой цепи с последующим фракционированием полученных пептидов хроматографическими методами. Для идентификации пептидов и соответствующих белков использовали тандемную масс-спектрометрию и специализированные программные продукты. В результате было идентифицировано более 170 индивидуальных белков, для которых проанализировано распределение по локализации в клетке и по функциям. Отдельной задачей исследования было получение информации о топологии идентифицированных мембранных белков. Решение трехмерной структуры мембранных белков представляет собой сложную задачу. Методы рентгеновской кристаллографии и ЯМР-спектроскопии довольно трудоемки, дорогостоящи и требуют больших затрат времени. В то же время результаты таких исследований не всегда дают представление о нативной структуре белка. Существующие в настоящее время вычислительные методы оценки топологии мембранных белков недостаточно точны. Получение информации о топологии мембранных белков протеомными методами имеет очевидные преимущества перед вышеперечисленными методами: меньшие затраты времени, высокая чувствительность и точность, нативность анализируемых белков, высокая производительность. Для изучения топологии белков внутренней мембраны митохондрий был разработан метод получения пептидов, относящихся к экстрамембранным («немембранные») и трансмембранным («мембранные») участкам белковой цепи, в виде отдельных фракций, которые далее анализировали протеомными методами независимо. По идентифицированным пептидам определяли белки, для которых затем можно было определить экстрамембранные участки и трансмембранные тяжи, сравнивая «немембранные» и «мембранные» пептиды с последовательностью целого белка. Для проверки достоверности получаемой информации среди идентифицированных белков выбрали те из них, для которых трехмерная структура была определена методами рентгеноструктурного анализа или ЯМР-спектроскопии. Результаты наших исследований сравнивали с известной трехмерной структурой отобранных белков. Была показана высокая достоверность идентификации и хорошая степень совпадения экспериментальных данных и трехмерной структуры.