BioScience Blog – Научный Биологический блог

Важным этапом в процессе создания трансгенных растений является эффективный отбор первичных трансформантов, содержащих в геноме встройку целевого гена, а также последующий анализ наследования трансгена в ряду поколений. Простым и экономичным методом для такого исследования является полимеразная цепная реакция. Однако для того, чтобы проанализировать трансформанты необходимо решить ряд задач: оценить качество препарата выделенной геномной ДНК (по амплификации гена домашнего хозяйства), выявить наличие в геноме транс формантов последовательностей целевых генов, селективного гена, репортерного гена, последовательностей регуляторных элементов генетических конструкций и определить отсутствие агробактериальной контаминации (по амплификации генов вирулентности агробактерий). Обычно для этого проводится ряд поочередных ПЦР в уникальных условиях и с использованием праймеров, подобранных к каждой из анализируемых последовательностей, что требует определенных материальных и временных затрат. Для преодоления этих сложностей нами была предпринята попытка разработать систему праймеров мультиплексной ПЦР, позволяющую определять наличие в геномной ДНК растений последовательностей нескольких генов и регуляторных элементов одновременно. Для разработки системы праймеров мультиплексной ПЦР были выбраны следующие гены: селективный ген, гены домашнего хозяйства исследуемых видов растений, гены вирулентности Agrobacteriumtumefaciensштамма AGLO, репортерный ген, ряд целевых генов и регуляторных элементов. Праймеры к исследуемым последовательностям были подобраны таким образом, чтобы условия их амплификации были схожими, а амплифицированные фрагменты можно было эффективно разделять в агарозном геле. Далее, были подобраны оптимальные соотношения каждого из праймеров системы и условия мультиплексной ПЦР, при которых происходит амплификация всех целевых последовательностей с одинаковой эффективностью.

Предложенная система праймеров, их оптимальные соотношения и условия мультилексной ПЦР успешно апробированы на модельных объектах (трансгенные растения табака и арабидопсиса) и на трансформантах сельскохозяйственно-важных культур (картофель, томаты, свекла, салат). Полученные результаты позволяют предложить разработанную систему праймеров, их соотношения и условия мультиплексной ПЦР как основу для эффективного отбора и анализа трансгенных растений.