BioScience Blog – Научный Биологический блог

Повышенный интерес к амплификации и высокочувствительной детекции нуклеиновых кислот и к разработке все новых способов их проведения объясняется тем, что это многомиллиардный и быстро растущий бизнес. Несмотря на то, что в основе разработанной нами новой цепной реакции лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР), из-за весьма существенных отличий, заключающихся главным образом в характере накопления целевых продуктов, по которому РЦР превосходит ПЦР на несколько порядков, мы назвали данную реакцию иначе – Рекуррентная Цепная Реакция, чтобы исключить длинное название данной реакции типа «ПЦР с увеличивающимся с каждым циклом коэффициентом размножения молекул ДНК» или «ПЦР с увеличивающимся с каждым циклом числом мест для отжига праймеров в составе ампликона». Особенностью РЦР является то, что в качестве прямого и обратного (вариант РЦР 2/2 – более продуктивная реакция) или только одного из них (вариант РЦР 2/1, характеризующийся преимущественным накоплением одной из цепей) используются праймеры, представляющие собой тандемно повторяющиеся последовательности одинарного (основного) праймера с расположением повторов в них по типу "голова к хвосту" и состоящие из двух или большего числа таких элементов. Помимо того, что с

каждым циклом происходит удлинение ампликона на длину одинарного праймера и увеличение для них числа мест отжига в составе ампликона, применение термостабильной ДНК полимеразы, обладающей активностью, смещающей цепь ДНК (вторая особенность РЦР), приводит к возникновению в каждом цикле двуцепочечного ампликона, а также построенных с впереди отжегшихся праймеров одиночных цепей ДНК, смещенных такой полимеразой, причем число таких ампликонов в виде одиночных цепей ДНК растет с каждым циклом, благодаря чему РЦР приобретает огромные преимущества по сравнению с ПЦР. РЦР 2/2 уже к 20-му циклу опережает ПЦР по степени размножения молекул ДНК не в 2 – 3 – 5 раз, а сразу на 5 порядков. Детекция протекания РЦР в реальном времени может осуществляться путем регистрации роста флуоресценции красителя типа SYBR Green I или с использованием гибридизационных зондов типа молекулярных сигнальных огней. Другим способом детекции результатов РЦР может быть контроль переноса флуоресцентной резонансной энергии от красителя-донора к красителю-акцептору, входящих соответственно в состав прямого и обратного праймеров, при условии отжига последних в непосредственной близости друг от друга. При этом нами разработан улучшенный способ такой детекции накопления ампликонов в реальном времени на платформе "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация, или "UFA" – Universal Fluorescent Amplification), no большинству параметров превосходящий аналогичные методы.

Помимо ПЦР разработано немало других методов амплификации нуклеиновых кислот, но ни один из них так до сих пор и не смог составить серьезной конкуренции ПЦР, несмотря на то, что некоторые по эффективности размножения молекул ДНК сравнимы или даже превосходят ПЦР, однако последняя заметно превосходит их благодаря простоте исполнения. Что касается РЦР, то при формировании реакционной смеси никаких принципиальных отличий в добавлении ингредиентов по сравнению с ПЦР нет, и после набора программы в термоциклере амплификация с помощью РЦР будет идти как обычная ПЦР. Учитывая это, на РЦР нами подана заявка на патент РФ, который в настоящее время переводится в международную фазу.