BioScience Blog – Научный Биологический блог

Важной задачей современной биологии и медицины является поиск препаратов, способных с высокой эффективностью селективно подавлять экспрессию определенных генов. Одними из претендентов на роль ген-направленных терапевтических агентов являются антисмысловые олигонуклеотиды (АсОДН), которые способны образовывать прочные специфические комплексы с внутриклеточными нуклеиновыми кислотами. АсОДН и их производные направлены на матричные РНК с целью ингибирования процесса трансляции. В настоящее время АсОДН находят применение в клинике для лечения онкологических заболеваний, ряда вирусных и бактериальных инфекций. Однако до сих пор недостаточно изучена эффективность проникновения олигонуклеотидов в клетки-мишени, а также зависимость эффективности проникновения олигонуклеотидов от их вторичной структуры. В связи с этим актуальным является изучение эффективности проникновения олигонуклеотидов различной вторичной структуры в клетки-мишени.

Нами были подобраны два АсОДН к мРНК EGFP (enhanced green fluorescent protein) и методами молекулярного моделирования показано, что АсОДН 5′-GAGCTGCACGCTGCCGTC-3′ формирует вторичную структуру, а АсОДН 5′-TCGCCCTTGCTCACCAT-3′ не формирует вторичную структуру. В работе было проведено исследование проникновения данных АсОДН, имеющих флуоресцентную метку TAMRA, в клетки эмбрионов мыши линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)lOsb/J от

стадии 2-х бластомеров до стадии бластоцисты (1,5-4,5суг. развития) и в клетки, полученные от эмбрионов мыши этой же линии 18,5сут. развития, культивируемые invitro. АсОДН добавляли в среду до конечной концентрации 1нмоль/мл, инкубировали в течение часа при 37°С и отмывали в среде без АсОДН. Методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии показано, что АсОДН, не формирующий вторичную структуру, проникает в клетки ранних эмбрионов мыши линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)lOsb/J на всех стадиях развития и локализуется в цитоплазме, но практически не проникает в клетки всех исследованных первичных культур (фибробласты кожи, жировые клетки, миобласты, МСК костного мозга), полученных из эмбрионов мыши 18,5 сут. развития. Возможно, это связано с тем, что в клетках ранних эмбрионов наблюдается более активный транспорт веществ внутрь клеток (эндоцитоз и свободная диффузия), чем в клетках эмбрионов на более поздних стадиях развития. Также было показано, что АсОДН, формирующий вторичную структуру, не проникает в клетки ранних эмбрионов мыши линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)lOsb/J до стадии компактизации (1,5 – 2,5сут. развития) и проникает в эмбрионы на стадиях компактизированной морулы и бластоцисты (2,5-4,5сут. развития) и локализуется в цитоплазме. Кроме того, было установлено, что этот АсОДН проникает в клетки всех исследованных первичных культур поздних эмбрионов мыши линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)lOsb/J и локализуется в цитоплазме, преимущественно в околоядерной области. Различия в проникновении АсОДН, формирующих и не формирующих вторичную структуру, в клетки эмбрионов разных стадий развития, дают возможность предполагать наличие разных доминирующих механизмов их поступления в клетки.