BioScience Blog – Научный Биологический блог

Расшифровка и анализ геномов организмов предоставили важную информацию о механизмах функционирования живых систем. Однако этих данных оказалось недостаточно для полного понимания всех процессов, происходящих в клетке. Следующим шагом в развитии системной биологии стала протеомика, в задачи которой входит изучение белкового состава клетки, а также локализации, функций и взаимодействий белков. Эукариотическая клетка содержит огромное количество различных белков, поэтому идентификация протеома целой клетки затруднена. В связи с этим целесообразным является разделение такой сложной смеси белков на подмножества – протеомы органелл.

Митохондрии являются жизненно важными органеллами клетки и играют большую роль в жизнедеятельности организма. Нарушения функций митохондрий могут привести к серьезным последствиям для клетки и целого организма. Успех работы по идентификации протеома митохондрий позволит найти новые молекулярные мишени для терапевтического вмешательства при лечении различных болезней, поможет создать новые более эффективные лекарства.

Для достижения более полного определения белков митохондрии дополнительно разделяли на три фракции: внешние и внутренние мембраны, а также растворимые белки матрикса и межмембранного пространства. Целью данного этапа исследований являлась идентификация растворимых белков митохондрий миокарда сердца Bostaurus. Эти белки анализировали двумя способами: 1) поиск белков по фингерпринтам пептидных масс; 2) стратегия многомерной идентификации белков MudPIT.

Согласно первому методу, были получены индивидуальные белки с помощью двумерного гель-электрофореза, вырезаны точки, соответствующие белкам на геле, и проведено триптическое расщепление на пептиды. Далее пептидные гидролизаты анализировали с помощью МАЛДИ-времяпролетной масс-спектрометрии, и по полученным фингерпринтам были определены белки.

Во втором эксперименте  обессоленные  белки обрабатывались трипсином,  из смешанного триптического гидролизата выделялись цистеин-содержащие пептиды с помощью аффинной хроматографии на колонке с тиопропилсефарозой. Пептиды, не сорбированные   на   колонке,    идентифицировали   с   помощью   масс-спектрометра, оснащенного   ИЭР   и   ионной   ловушкой,   совмещенного   «онлайн»   с   двумерной хроматографией. Цистеин-содержащие пептиды элюировали с аффинной колонки β-меркаптоэтанолом, модифицировали иодацетамидом и фракционировали с помощью обращеннофазовой    ВЭЖХ.    Полученные    образцы    анализировали    на    МАЛДИ-времяпролетном масс-спектрометре. В результате было определено около 220 белков. MudPIT – Multidimensional Protein Identification Technology МАЛДИ — матрично-активированная лазерная десорбция-ионизация ИЭР — ионизация электрораспылением