BioScience Blog – Научный Биологический блог

Шалгуев В.И.

Петербургский институт ядерной физики, Гатчина (Россия). E-mail: shalguev@omrb.pnpi.spb.ru

Одним из важных этапов изучения механизма гомологической рекомбинации (ГР) у эукариот является получение в препаративных количествах высокоочищенных белков — ключевых участников ГР. Хорошо известно, что белок Rad51 и его паралоги — основные участники ГР. Цель данного исследования — разработка метода получения высокоочищенных Rad51-подобных белков H. sapiensв препаративных количествах для биохимического анализа. Существует проблема экспрессии некоторых эукариотических генов в бактериях: экспрессированные рекомбинантные белки, например, отдельные белки H. sapiens, часто переходят в нерастворимое состояние, образуя тельца включения. Один из способов предотвращения образования телец включения — это добавление к аминоконцевым последовательностям рекомбинантных белков домена белка SUMO (small ubiquitin-like modifier). Домен SUMO обеспечивает шаперонный эффект и способствует увеличению растворимости полученных химерных белков. Клонирование кодирующих последовательностей человеческих белков Rad51B, Rad51C, Rad54 было проведено таким образом, что каждый ген на отдельной плазмиде оказался слитым (в одной рамке считывания) с лидерной последовательностью, кодирующей домен SUMO, и участком узнавания специфической протеазы SUMO. Для клонирования использовали плазмидные векторы pET21d (Novagen) и pASK-IBA2 (IBA), кодирующие в лидерной последовательности аффинные эпитопы двух видов: полигистидиновый (6xHis) либо стрептавидиновый (TrpSerHisProGlnPheGluLys) тракты. В результате экспрессии полученных конструкций продуцировались химерные белки Rad51B, Rad51C либо Rad54, каждый из которых содержал в лидерной последовательности: в одном случае эпитоп His6-SUMO, в другом — Strep-SUMO. Кодоновую оптимизацию обеспечили синтезом invivoдополнительных тРНК (tRNAArg3 и tRNAArg4), локализованных на отдельной плазмиде. Анализируя экспрессию плазмид в клетках BL21(DE3)ДrecA, оценили молекулярные массы рекомбинантных белков человека Rad51B (≈55 кДа), Rad51C (≈60 кДа), Rad54 (≈100 кДа). Аффинная хроматография белка Rad51C на Ni2+-NTA агарозе и последующий протеолиз белка протеазой SUMO подтвердил наличие отщепляемого N-концевого эпитопа His6-SUMO (≈15 кДа), слитого с белком Rad51C (≈45 кДа). Таким образом, была показана принципиальная возможность применения предложенных векторов для экспрессии и выделения нативных белков Rad51B, Rad51C, Rad54 в E.coli.