BioScience Blog – Научный Биологический блог

Транскрипция – синтез РНК на матрице ДНК – является важнейшим клеточным процессом, который включает несколько стадий: узнавание РНК-полимеразой особого сигнала – промотора; образование открытого промоторного комплекса; собственно инициация синтеза мРНК; элонгация и терминация. Количество синтезируемой РНК в бактериях регулируется преимущественно на уровне взаимодействия фермента с промотором, что в значительной мере определяется структурой последнего. Сравнительный анализ более 500 последовательностей промоторов, узнаваемых РНК-полимеразой E.coli(наиболее изученный фермент этого класса), позволил выявить два участка структурной гомологии в области -10-го и – 35-го нуклеотидов, T1A2 T3A4A5T6g7 и T1T2G3A4C5A6 (индекс справа вверху – принятая нумерация звеньев в пределах консенсуса), соответственно [1]. Любопытно, что ни в одном из природных сигналов инициации транскрипции полного соответствия в упомянутых областях указанным консенсусным последовательностям не обнаружено. До сих пор нет надежной количественной оценки значимости каждой из нуклеотидных пар в ключевых позициях консенсусных элементов -10-ой и 35-ой областей для эффективного функционирования промотора.

В настоящей работе впервые предложена и опробована удобная тест-система количественной оценки относительной силы промоторов, сконструированная на базе плазмидного вектора, содержащего два дивергентно направленных терминатора λоор. Возможность встраивания двух промоторов (например, природной структуры и модифицированного) навстречу друг другу в межтерминаторной области, а также наличие в тест-векторе «независимого» промотора «RNA1» (внутренний стандарт) позволяет в этой тест-системе достаточно точно определять «силу» (активность) сигналов инициации транскрипции друг относительно друга.

Для количественной оценки влияния замен наиболее консервативных нуклеотидных пар в составе – 10-го и – 35-го районов сконструирован набор мутантных промоторов с заменами в позициях 1, 2 и 3 гексануклеотида – 35-ой области и в позициях 1, 2, 6 и 7 гептануклеотида -10-ой области. Полученные мутантные промоторы были встроены в тест-вектор «навстречу» консенсусному («обобщенному») промотору и исследованы в системе транскрипции invitro.

Литература

Shultzaberger, R. K., Chen, Z., Lewis, K.A., Schneider, T.D. (2007) Anatomy of Escherichia coli s70 promoters //Nucl.Acids Res., v. 35, No. 3, p. 771-788.