BioScience Blog – Научный Биологический блог

Протеасомы – это мультикаталитические протеазные комплексы, которые встречаются как в ядре, так и в цитоплазме клеток большинства организмов. Под словом "протеасома" обычно подразумевается 26S протеасома, состоящая из 20S коровой частицы и двух ассоциированных с ней 19S регуляторных комплексов. 20S протеасома представляет собой полый цилиндр, составленный из субъединиц двух типов: аир. Протеолитические центры протеасомы расположены на трех Р-субъединицах. Субъединицы а-типа, в свою очередь, обеспечивают регулируемый доступ субстрата и присоединение регуляторных комплексов. Важнейшей функцией протеасом на протяжении долгого времени считалось участие в убиквитин-зависимом расщеплении белков, однако в 1990х годах было впервые показано наличие у 20S протеасом эндорибонуклеазной активности. Впоследствии были идентифицированы две а-субъединицы, обладающие РНКазной активностью, а также была обнаружена способность 26S протеасом к расщеплению РНК. Кроме того, была показана, что способность 20S протеасом и их отдельных субъединиц расщеплять мРНК находится в зависимости от посттрансляционных модификаций. В исследованиях последних лет продемонстрировано участие некоторых субъединиц регуляторного 19S комплекса в регуляции транскрипции. Таким образом, есть основания рассматривать протеасому как важный элемент системы регуляции экспрессии генов на различных этапах. В силу неоценимой важности убиквитин-зависимого протеолиза для жизнедеятельности любой клетки, внимание большинства исследователей сосредоточено на изучении механизмов протеолитических активностей протеасом, и, таким образом, исследование РНКазы протеасом остается в тени.

Целью данной работы является локализация РНКазного центра в составе субъединицы а5 (зета). Анализ третичной структуры данного белка позволил локализовать потенциальные активные центры; они представляли собой последовательности трех аминокислотных остатков: H186-S188-E193 и Н227-Т230-D233. Последовательность дикого типа кДНК субъединицы а5 человека была клонирована в экспрессионный вектор pGEX, и на ее основе был получен химерный белок а5, слитый с GST; a5-GST был экспрессирован в Е. coli, т.е. не нес посттрансляционных модификаций. Для этого белка были подобраны оптимальные условия проявления им РНКазной активности. В соответствии с целями работы нами были получены экспрессионные векторы pGEX-5X-3-a5, pGEX-5X-3-a5-H186A и pGEX-5X-3-a5-H227A, содержащие соответственно ген субъединицы а5 и последовательности а5, несущие точечные мутации в 186 или 227 положениях (для инактивации потенциальных РНКазных центров); была исследована способность а5 и мутантных белков к расщеплению РНК. В качестве субстрата РНКазной активности белков была использована меченная [32Р] мРНК гена человека р53. Продукты нуклеолиза анализировали с помощью денатурирующего электрофореза высокого разрешения. Эксперименты показали, что мутантный белок Н186А, как и белок дикого типа, обладает РНКазной активностью, в то время как замена гистидина на аланин в 227 положении существенно подавляла эндорибонуклеазную активность соответствующего мутантного белка. Таким образом, есть основания полагать, что РНКазный центр субъединицы а5 образован аминокислотными остатками H227-T230-D233.