BioScience Blog – Научный Биологический блог

Шаперонин TRiC (TCP-1 Ring Complex), так же известный как CCT (Cytosolic Chaperonin containing TCP-1), – большой мультисубъединичный белковый комплекс, опосредующий фолдинг белков в цитоплазме эукариотических клеток. Известно, что TRiC осуществляет сворачивание определенных белков, таких как актин, тубулин, нейрофиламент и некоторых других, но спектр его субстратов до сих пор остается определенным лишь частично. Известна возможность шаперонина предотвращать некоторые случаи агрегации, но возможность TRiC препятствовать термоагрегации белков неизвестна.

С помощью анализа известных методик получения TRiC был разработан простой метод выделения данного шаперонина из семенников барана. Данная методика позволяет выделить шаперонин всего в три стадии: высаливание сульфатом аммония, ультрацентрифугирование и хроматография на гепарин-сефарозе. С помощью SDS-электрофореза и определения размеров частиц методом динамического лазерного светорассеяния ("Zetasizer Nano-ZS", Malvern, U.K.) было показано, что выделенный препарат гомогенный, и молекулярный вес субъединиц соответствует данным в литературе. Также был проведен масс-спектрометрический анализ аминокислотного состава выделенного белка, в результате которого было идентифицировано 7 (из 8 разных) субъединиц TRiC. Полученный препарат шаперонина TRiC инкубировали в присутствии денатурированной мономерной формы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД), иммобилизованной на сефарозе 4В. После анализа проб при помощи SDS-электрофореза было показано, что TRiC связывается с ГАФД, денатурированной в присутствии 4М гуанидингидрохлорида. Однако при проведении реактивации денатурированных форм ГАФД и лактатдегидрогеназы, шаперонин-зависимая реактивация была возможна только в случае последнего фермента. В данной работе также изучалось влияние TRiC на термоагрегацию ГАФД и способность шаперонина к образованию комплексов с термоденатурированными формами фермента. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) было показано, что при нагревании TRiC в присутствии ГАФД не наблюдаются изменения кривой теплопоглощения, что свидетельствует об отсутствии взаимодействия между исследуемыми белками в данных условиях. Кроме того был проведен анализ влияния шаперонина на тепловую агрегацию ГАФД. Как и в случае ДСК, было продемонстрировано отсутствие связывания и «защиты» ГАФД от термоагрегации.

Таким образом, данная работа проливает свет на такие общие характеристики малоизученного шаперонина TRiC, как субстратная специфичность и влияние на процессы агрегации.