Габбасов Р.Т., Мухаметшина Н.Е., Горина С.С., Гоголев Ю.В. СРАВНЕНИЕ НЕКОТОРЫХ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ТОТАЛЬНОЙ РНК ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕГО ИЗУЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТЫ СЕМЕЙСТВА CYP74 ЛЬНА-ДОЛГУНЦА (LINUM USITATISSIMUM)
Ферменты липоксигеназной сигнальной системы — цитохромы Р-450 макросемейства CYP74 и липоксигеназы — играют важную роль в устойчивости растений к патогенам. В листьях льна (Linum usitatissimum) обнаружены дивинилэфирсинтазная и алленоксидсинтазная активности ферментов мействасе CYP74. Изучение первичной структуры и экспрессии этих ферментов представляет большой интерес.
Целью данной работы являлось сравнение некоторых методов выделения РНК из клеток льна-долгунца (Linum usitatissimum), которая затем использовалась при получениии обратных транскриптов генов
ферментов семейства CYP74. Были сформулированы следующие задачи: (1) выделить мРНК из листьев льна тремя способами: горячим фенольным методом, методом с использованием реагента TRIzol фирмы Invitrogen и методом с использованием набора реагентов Yellow Solve фирмы Силекс; (2) сравнить качество и количество мРНК, выделенной тремя способами; (3) поставить реакцию обратной транскрипции и полимеразную цепную реакцию с вырожденными праймерами комплементарными последовательностям вгено представителей семейства CYP74.
Выделенные РНК суспензировали в воде и измеряли их концентрацию двумя методами: с помощью флюориметра Qubit и спектрофотометра NanoDrop. В качестве конечных данных взяты средние арифметические данных, полученных на приборах. Выделенные РНК были также разделены в 1,5% агарозном геле. Далее была проведена реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная реакция с вырожденными праймерами, комплементарными консервативным сайтам генов ферментов CYP74, кодирующие последовательность на 1000 п.о.
Получены следующие результаты. При выделении тотальной РНК горячим фенольным методом концентрация РНК составила 0,851 мкг/мкл. На электрофореграмме раствора РНК хорошо виден обширный пул мРНК, необходимых для проведения обратной транскрипции. В то же время, судя по электрофореграмме, в пробе присутствует фрагмент геномной ДНК (более 10 тыс. п.о.). На электорфорегремме ампликонов после ПЦР наблюдается свечение фрагмента на 1000 п.о. (рис. 1).
Концентрация РНК, выделенных с реагентом TRIzol составила 0,545 мкг/мкл. Однако на электрофореграмме раствора РНК пул мРНК почти неразличим (рис. 2), ПЦР также дала отрицательный результат.
Концентрация РНК, выделенных при помощи набора YellowSolve составила 0,094 мкг/мклл. Пу мРНК на электрофореграмме едва различим (рис. 3), ПЦР дала отрицательный результат.
Таким образом, при сравнении трех методов было выяснено, что наилучшим методом выделения РНК, которую затем можно использовать при изучении экспрессии генов, является горячий фенольный метод выделения РНК. Фрагмент геномной ДНК, присутствующий в пробе, не влияет на работу отрицательно. Метод с использованием готового реагента TRIzol и набора YellowSolve не являются пригодными для подобного рода работ из-за низкого выхода мРНК.
Loading ...