BioScience Blog – Научный Биологический блог

В настоящее время существует проблема получения устойчивых форм растений, приспособленных к различным условиям среды. Известно, что при низких температурах снижается текучесть мембран, и, как следствие, происходит разобщение связей мембранных белков, что в свою очередь приводит к нарушению транспорта веществ через плазматическую мембрану. Итогом таких изменений является нарушение клеточного метаболизма, что может привести к гибели всего организма. Увеличение уровня ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов помогает клетке сохранить нормальный уровень текучести мембран при холодовом стрессе. Количество и степень ненасыщенных жирных кислот в липидах мембран контролируются ферментами десатуразами. Мы предположили, что перенос и экспрессия в растениях гетерологичных генов десатураз в растительных клетках будет изменять количество ненасыщенных жирных кислот в липидах мембран, что приведет к увеличению устойчивости растений к ряду стрессовых воздействий: изменение температур и осмотический стресс.

Цель работы заключалась в создании экспериментальных моделей трансгенных растений, устойчивых к стрессовым факторам, за счет экспрессии генов десатураз с различной субстратной специфичностью. В качестве модельного объекта были выбраны растения табака (Nicotianatabacum), для которого разработаны системы регенерации и трансформации in vitro. В качестве целевого гена был взят ген desC из цианобактерии Synechocystis sp PCC 6803, кодирующий Δ9-десатуразу. Поскольку десатуразы обладают ферментативной активностью, которую можно определить, используя трудоемкие методы, были сконструированы гибридные гены, в которых целевые гены десатураз трансляционно слиты с последовательностью репортерного гена термостабильной лихеназы. Использование репортерной системы термостабильной лихеназы в дальнейшем позволит провести быстрый отбор полученных трансформантов-растений, экспрессирующих целевой ген, по ферментативной активности лихеназы, а также оценить уровень экспрессии введенных генов. Помимо этого, ранее в клетках модельных прокариот было показано, что в составе гибридных белков как лихеназа, так и десатураза сохраняют свои основные свойства: лихеназа сохраняет активность и термостабильность, а десатураза – способность катализировать введение двойных связей в остатки жирных кислот. Были сконструированы растительные экспрессионные вектора, несущие нативный и гибридный ген десатуразы, под контролем конститутивного промотора. Этими векторами был трансформирован штамм агробактерий (Agrobacteriumtumefaciens). Агробактериальные трансформанты были использованы для трансформации растений табака методом листовых дисков. Первичные трансформанты табака были отобраны на среде с селективным агентом – канамицином, поскольку оба вектора содержали кассету устойчивости к этому антибиотику. Методом ПЦР был проведен отбор первичных трансформантов табака, которые несут в геномной ДНК последовательности перенесенных генов. Отобранные таким образом первичные трансформанты табака использованы для размножения в культуре invitroи invivoдля проведения дальнейших молекулярно-генетических и физиолого-биохимических исследований.