BioScience Blog – Научный Биологический блог

Климук Е.И., Буник В.И.

2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс (ОГДК) катализирует необратимую деградацию 2-оксоглутарата в точке пересечения метаболизма углеводов и аминокислот. Многие нейродегенеративные заболевания сопровождаются частичной инактивацией комплекса мозга. Специфическое ингибирование ОГДК мозга позволяет моделировать такие патологии и охарактеризовать физиологические последствия снижения активности ОГДК. Данная работа посвящена разработке метода специфического ингибирования ОГДК мозга синтетическими аналогами 2-оксоглутарата, в которых отщепляемая карбоксильная группа замещена на фосфоновую. Высокое структурное сходство с субстратом при невозможности разрыва С-Р связи обеспечивает аффинное ингибирование фосфоноаналогами за счет образования прочного тройного комплекса между аналогом, 2-оксоглутаратдегидрогеназой и ее коферментом – тиаминпирофосфатом. Для улучшения клеточной проницаемости ингибиторов внутриклеточных ферментов применяют модификации, нейтрализующие заряд ингибиторов. В связи с этим в работе были исследованы сукцинилфосфонат и ряд его этилированных производных. Стабильность исходных веществ и используемых растворов была подтверждена спектрами ЯМР. Исследование проводили на частично очищенных препаратах ОГДК мозга крыс.

Показано, что ингибирующая способность фосфоноаналогов падает в ряду сукцинилфосфонат (СФ) > карбоксиэтил сукцинилфосфонат (КЭСФ) > фосфоноэтил сукцинилфосфонат (ФЭСФ) > карбокси, фосфоно-диэтилсукцинилфосфонат (ДЭСФ). При насыщающей концентрации 2-оксоглутарата (2мМ ~ 20*КmOГ) величины I50 составляют: 7мкМ, 25мкМ и >150 мкM для СФ, КЭСФ и ФЭСФ/ДЭСФ, соответственно. Преинкубация карбокси, фосфоно-диэтилсукцинилфосфоната с экстрактом мозга крыс в течение 90 мин не приводила к изменению его ингибирующей способности. Это свидетельствует об отсутствии эстеразной активности мозга в отношении эфирных связей фосфонатов в условиях экспериментов по ингибированию ОГДК. При низких (2-4 мкМ) концентрациях СФ и КЭСФ можно наблюдать увеличение их ингибирующей способности но 30-40% в результате преинкубации с ферментом. Очевидно, конформационные изменения первичного фермент-ингибиторного комплекса приводят к более прочному связыванию ингибитора с ферментом. Аналогичный эффект наблюдали и для ФЭСФ (60 мкМ). Полученные данные указывают на двухстадийный механизм взаимодействия фосфонатов с ОГДК и определяющий вклад фосфонатной группы СФ в ингибирование ОГДК мозга.