BioScience Blog – Научный Биологический блог

Смирнова О.Д.

Культивация клеток invitroдля исследования их свойств, для генетических модификаций и для дальнейших трансплантаций требует постоянного неповреждающего контроля за численностью, жизнеспособностью, генетическим статусом и экспрессией исследуемых генов всей культуры клеток в целом (~106 штук). Живая клетка – сложная открытая коллоидная система сбалансированных сил. Натяжение её мембран уравновешивается и электродинамическими процессами, – в результате на каждом определённом этапе клеточного цикла и генетического статуса поддерживается гомеостаз физико-химических параметров фазового состава клетки. Специфическая для данного статуса форма (проявляемая при прикреплении клетки к подложке и необходимая для дифференцировки и генетической экспрессии) неотъемлемо связана с организацией цитоскелета. Это отражается на параметрах светорассеяния.

В работе было экспериментально исследовано влияние жизнеспособности, численности и генетического статуса клеток в культуре на спектральные характеристики её нормального светопоглощения с целью дальнейшей разработки методики неповреждающего контроля за генетическим статусом культурируемых клеточных линий invitro. Для этого были созданы генетические конструкции, содержащие вставки генов нейральных факторов: GDNF, NGF, BDNF – и маркерного флюоресцентного белка GFP, – которыми были трансфецированы клетки НЕК-293 и Сб. Полученные клетки культивировались в специальных флаконах, где клетки оседали и прикреплялись к плоскому дну, образуя монослой. Разработанная В.А. Павловым спектрофотомерическая установка позволила регистрировать интенсивность пропускаемого через образцы света в диапазоне 400+720 нм с одновременной визуализацией через окуляр микроскопа. Для всех исследуемых клеточных линий были получены спектры поглощения, результаты которых    были    сопоставлены    с    соответствующими    спектральными    данными, полученными на спектрофотометрах Genesys 10UV и Ultrospec П 4050.

В результате было выявлено, что каждый тип культуры характеризуется своим уникальным спектром поглощения, в зависимости от формы клеток, их плотности и межклеточной организации. Выявлен набор спектральных участков, соотношение величин нормального светопоглощения по которым способно характеризовать генетический статус исследуемых клеток. Таким образом, каждому типу клеток и их организации
invitroможет быть сопоставлен набор чисел, характеризующих величину относительного поглощения в культуре на участках спектра, которые наиболее различны для разных типов, – относительно выбранного наиболее устойчивого (с минимальным для всех культур светорассеянием).