BioScience Blog – Научный Биологический блог

Островерхова Т.Е., Пепелина Т.Ю., Черткова Р.В.

Наряду с функцией переноса электрона в дыхательной цепи цитохром с проявляет антиоксидантную активность в отношении активных форм кислорода (АФК). Целью данной работы являлось создание мутантных вариантов цитохрома с, лишенных дыхательной функции, но сохранивших антиоксидантную. Мутантный вариант цитохрома с, неспособный к переносу электрона от убихинон-цитохром с оксидо-редуктазы(комплекс
III) на цитохром с — оксидазу(комплекс IV), является потенциальной основой для создания тест-систем, определяющих АФК.

Ранее нами были предложены два варианта цитохрома с, несущих двойную мутацию: 1) K86W/K87C и 2) К86Е/К87Е. Введение данных мутаций в ген цитохрома с в составе экспрессионного плазмидного вектора pBPCYCl осуществлялся методом сайт-направленного мутагенеза с использованием QuikChange™ Mutagenesis Kit (Stratagene, США). Векторная система pBPCYCl, разработанная Pollock et.al, 1998 и модифицированная нами, позволяет проводить ко-экспрессию гена цитохрома с с геном дрожжевой гем-лиазы. Препаративную экспрессию мутантных вариантов проводили в клетках E.coliштамма JM 109 при 37°С в питательной среде SB в течение 24 часов. Выделение белка из супернатанта, полученного в результате разрушения клеток на установке «French Press» и центрифугирования, осуществляли согласно модифицированной двухстадийной схеме, разработанной ранее Abdullaev et al, 2002. На первом этапе проводили катионообменную хроматографию на сорбенте Mono S. В ходе хроматографии были отмечены изменения свойств мутантного варианта цитохрома с с заменами К86Е/К87Е. Уменьшение суммарного положительного заряда белка привело к тому, что этот белок слабо связывался с анионными группами сорбента. Дальнейшую очистку белка проводили с помощью адсорбционной хроматографии (гидроксиапатит). Наиболее чистые фракции объединяли, трижды диализовали против 10 мМ NH4HCO3 и лиофилизировали.

Окислительно-восстановительные свойства полученных мутантов исследовались на препаратах митопластов, полученных из печени крысы. Сукцинат цитохром с – редуктазную активность измеряли с помощью спектрофотометрического метода при 550 нм. Константа Михаэлиса (Км) для K86W/K87C уменьшилась в 10 раз, что указывает на повышение сродства комплекса IIIк мутантной форме; при этом каталитическая активность комплекса IIIснизилась в 2,6 раза. Км для К86Е/К87Е увеличилась в 10 раз, что указывает на ухудшение сродства комплекса IIIк мутантной форме; при этом каталитическая активность комплекса IIIне изменилась. Цитохром с — оксидазная активность измерялась полярографическим методом. Было показано, что Км для K86W/K87C и активность комплекса IV не изменились, в то время как Км для К86Е/К87Е увеличилась в 10 раз, что указывает на ухудшение сродства комплекса IV к этим мутантным формам; при этом каталитическая активность комплекса IV снизилась в 2,5 раза. Таким образом, изменение заряда на противоположный в 86 и 87 положениях цитохрома с привело к ухудшению сродства комплексов Ш и IV к полученному мутанту.

В настоящее время осуществляется работа по введению в ген мутантного варианта К86Е/К87Е дополнительных мутаций, направленых на максимальное выключение сайтов связывания с комплексами IIIи IV.