BioScience Blog – Научный Биологический блог

Д.М. Чудаков, Ю.В. Малеева, А.А. Колесников

Предложена методика картирования области инициации репликации (ori) на примере митохондриального (мт) генома паразита пасленовых Phytophthorainfestans -представителя группы оомицетов. К настоящему времени ни для одного организма из этой большой группы не показан механизм и участок (участки) ori мт ДНК. Известен полный сиквенс мт ДНК P.infestans(Lang, Forget, 1993), что делает возможным тестирование выделенных и дифференцированных по размеру насцентных (растущих) цепей ДНК на содержание последовательно расположенных фрагментов генома. Такой подход уже показал свою эффективность (Muller & Grummt, 1991; Falaschi et al., 1993; Staib & Grummt, 1997).

Новым в настоящей работе является предложенный метод очистки насцентных цепей: Суммарную ДНК разгоняют в 1.5% агарозном геле. При этом дробные фрагменты ДНК, составляющие конкуренцию при анализе насцентных цепей, выходят в гель в виде так называемого «шмера». Основная масса продукта локализуется в пределах узкой полосы ДНК, статистически порванной в процессе выделения (~30 тнп). Эта полоса содержит как обычные дуплексы ДНК, так и дуплексы, включающие растущую цепь ДНК. Фрагмент, содержащий суммарную ДНК, вырезают из обычного геля и переносят в денатурирующий (50-100mM NaOH). В щелочных условиях ДНК денатурирует, высвобождая насцентную цепь. Короткие насцентные цепи отделяются от основной массы ДНК, выходят в гель и разделяются по размеру. ДНК выделяют из участков геля электроэлюцией и тестируют на содержание последовательно расположенных фрагментов генома:

Достоинствами предложенного метода являются его простота, универсальность, а также отсутствие необходимости в использовании радиоактивных изотопов и дорогостоящих систем очистки насцентных цепей ДНК с использованием антител.