BioScience Blog – Научный Биологический блог

Чернятина А.А.

В современной биоинженерии часто требуется «включить» и «выключить» определенный ген в строго определенный момент. Это может потребоваться для наработки токсичных продуктов, селекции определенных колоний. Для выполнения этих задач требуется конструкция, способная встроить блок генов – Кассету, способную к автовырезанию под действием внешнего сигнала. В качестве исходного материала идеально подошла ДНК фага А, способного к сайт-специфической рекомбинации в бактериальную хромосому. Такая Кассета успешно создана – суицидная плазмида, способная легко интегрироваться в бактериальную хромосому Е. coliи автовырезаться из неё под действием индуктора – изопропил-13 – D-тиогалактозида (ИПТГ).

Сайт-специфическая система фага А: attP-сшт, гены xis, int, находится под контролем гибридного промотора Р&ыаоа-з. Репрессором Р&ыаеам является продукт экспрессии гена lad, который специально введен в Кассету, а также присутствует в хромосоме Е. Coli, чтобы не происходило самопроизвольного, без ИПТГ, вырезания плазмиды. На начальных стадиях введения Кассеты в клетку, используется плазмида-хэлпер pMWts-Plac-lacI, нарабатывающая Lad, а затем разрушающаяся под действием температуры. Интегративная Кассета несет oriсайт плазмиды R6k, поэтому способна к репликации только в Pir+ штамме. После трансдукции в Pir- штамм Е. coli, Кассета не реплицируется.

После создания Кассеты оставалась проблема – фаг А способен к реинтеграции, что было нежелательно. Также эксцизия Кассеты под действием индуктора происходила не всегда. Эти задачи были решены использованием системы токсин-антитоксин (ТА) бактерии Е. Coli. В качестве токсина взят белок MazF, убивающий клетку хозяина. Подавить действие токсина способен белок MazE, в норме продуцируемый ТА системой. В Кассету вставлен ген токсина mazF, являющегося контр-селективным маркером. Ген mazFнаходится под контролем промотера Parab, этот промотер не течет (в отличие от Plac), т.е. токсин не проявляется в отсутствие арабинозы – положительного индуктора Varab. Кассета вводится в бактерию Е. coliв присутствии плазмиды-хэлпера pRSFsacb-Plac-lacI-mazF (несущей ген антитоксина mazE). Такая система позволила производить отсев штаммов, в которых при добавлении ИПТГ не произошло автовырезания, управлять системой запуска экспрессии токсина независимо от экспрессии эксцизии.

Итак, создана Кассета, способная встраиваться и самовырезающаяся из хромосомы Е. coliпри добавлении ИПТГ. Реинтеграция кассеты и не полная эксцизия исключаются посредством действия токсина в арабинозной среде.

Литература

1. 
Xiao-Zhou Zhang, Xin Yan, Zhong-Li Cui, Qing Hong and Shun-Peng Li. «MazF, a novel conter-selectable marker for unmarked chromosomal manipulation in Bacillus subtilis».

2.  Andreas Haldimann, Barry L. Wanner «Conditional-Replication, Integration, Excision, and Retrieval Plasmid-Host Systems for Gene Structure-Function Studies of Bacteria»

3.  Shahar Amitai, Yussuf Yassin, and Hanna Engelberg-Kulka «MazF-Mediated Cell Death in Esherichia coli: a Point of No Return»