BioScience Blog – Научный Биологический блог

Эфриновые рецепторы входят в состав обширного семейства с тирозинкиназной активностью. Они участвуют в процессах эмбриогенеза и ангиогенеза, в регуляции межклеточных взаимодействий и миграции клеток. Эфриновые рецепторы представляют собой интегральные мембранные гликопротеины с единственным трансмембранным доменом (ТМ), которые активируются с образованием димерного комплекса. Основной вклад в формирование этого комплекса вносит взаимодействие внеклеточных доменов. Данные, полученные ранее в модельных липидных системах для пептидов, соответствующих ТМ эфринового рецептора Al (EphAl), позволяют предположить, что он способен участвовать в лиганд-опосредованной димеризации, и, таким образом, влиять на активацию EphAl. Для исследования димеризации EphAl созданы плазмиды, кодирующие ген полноразмерного рецептора EphAl в единой конструкции с циановым (EphAl-CFP), либо желтым (EphAl-YFP) флуоресцирующими белками, которые образуют донор-акцепторную пару, широко используемую для исследований с помощью метода резонансного переноса энергии флуоресценции. Для проверки гипотезы об участии ТМ EphAl в его димеризации предложено создать мутантные формы EphAl-

YFP (EphAl-CFP) с точечными заменами в ТМ рецептора, которые позволят выявить участие отдельных аминокислотных остатков в стабилизации димера. Полученные конструкции будут использованы для исследования димеризации EphAl в мембране эукариотических клеток с применением методов флуоресцентной микроскопии. В данной работе были препаративно наработаны и выделены плазмиды EphAl -YFP и EphAl-CFP. Определена чистота целевых продуктов методами электрофореза и спектрофотометрии. Показано, что после трансфекции в клетках синтезируются EphAl-YFP и EphAl-CFP, которые, как и ожидалось, транспортируются и накапливаются в плазматической мембране. Предполагается, что димеризация может происходить с участием одного или сразу двух сайтов, присутствующих в составе ТМ EphAl: GLLLG, ALLLG. Для проверки участия в димеризации каждого из этих сайтов ведутся работы по получению 6 мутантов: G558I; G554I; G564I; A560S; G554I, G558I; A550G, A560F. Создание мутантных форм EphAl проводится методом сайт-направленного мутагенеза в векторе pcDNA3.1(+) и pTagYFPN.