BioScience Blog – Научный Биологический блог

В последние годы активно исследуются белки, участвующие в модификации нуклеиновых кислот, в том числе и нуклеазы, которые принимают участие в таких фундаментальных генетических процессах, как репликация, репарация и рекомбинация ДНК.

Целью данной работы является определение влияния мутантных эндонуклеаз Serratia marcescens и Anabaena sp. на репликацию плазмидной ДНК в клетках рекомбинантных штаммов Escherichia сoli при базальном уровне экспрессии их генов.

В работе использовались плазмиды pHisNucSma
и pHisNucA, несущие гены исходных и мутантных эндонуклеаз S. marcescens и Anabaena sp., принадлежащих к омуодн семейству эндонуклеаз. При замене His в 89 положении на Ala у эндонуклеазы S. marcescens [1] и His в 124 положении на Ala у Anabaena sp. [2] были получены функционально неактивные белки. Замена Arg в 57 положении на Ala снижает активность нуклеазы S. marcescens на 65% [1], а замена Trp
в 159 положении на Ala дает 10% от активности нуклеазы Anabaena sp. [2]. Нуклеазная активность исследуемых штаммов определялась при помощи индикаторного агара, содержащего краситель толуидиновый голубой и высокополимерную ДНК [3]. Для некоторых представителей этого семейства нуклеаз было показано участие в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК [4].

Методом йодометрического титрования [5] было установлено количество β-лактамазы (фермента, расщепляющего ампициллин), синтезируемое каждым рекомбинантным штаммом: β-лактамазная активность раздого выше у штаммов, несущих плазмиды
pHisNucSma, чем у штаммов с плазмидами pHisNucA. Также было показано, что β-лактамазная активность у клеток с нуклеазой S. marcescens возрастает с увеличением активности нуклеазы: наибольшая β-лактамазная активность наблюдается у

клеток E.
coli с нуклеазой S. marcescens
дикого типа, наименьшая – у клеток с нуклеазой с нулевой активностью. При наличии в клетках эндонуклеазы АпаЪаепа
sp. наблюдается обратная картина: наибольшей β-лактамазной активностью обладает штамм с неактивной нуклеазой, наименьшей — с нуклеазой дикого типа. Т.к. увеличение количества β-лактамазы в клетках сопровождается увеличением уровня резистентности к ампициллину и поскольку ген β-лактамазы находится в вышеописанных плазмидах, то такие изменения, скорее всего, являются следствием увеличения числа плазмидных копий [6].

Налидиксовая кислота является агентом, подавляющим действие ДНК-гиразы и топоизомеразы I — ферментов, разрешающих топологические проблемы, связанные со спирализацией-деспирализацией ДНК [7]. Наибольшая устойчивость к этому агенту наблюдается у клеток с нуклеазой S. marcescens
дикого типа, что может свидетельствовать о вероятном участии в репликации данной нуклеазы, действующей подобно ДНК-гиразе, инициирующей образование «ников» в области ori.
Устойчивость к налидиксовой кислоте у штамма с нуклеазой Anabaena sp. дикого типа меньше, чем у бесплазмидного штамма. Это может объясняться ее повышенной токсичностью для клетки по сравнению с нуклеазой S.
marcescens, что подтверждается присутствием данной плазмиды в клетках всего в 1-2 копиях.

Литература

1.                                                                              Friedhoff P. et al.
Identification of catalytically relevant amino acids of the extracellular Serratia marcescens endonuclease by alignment-guided mutagenesis // Nucl. Acids Res. – 1994. – V. 22. – P. 3280-3287.

2.                                                                              Meiss G. et al. Mechanism of DNA Cleavage by the DNA/RNA-nonspecific Anabaena sp. PCC 7120 Endonuclease NucA and its Inhibition by NuiA // J. Mol. Biol. – 2000. – V. 297. – P. 521-534.

3.                                                                              Meiss G. et al. Microtiter-plate assay and related assays for nonspecific endonucleases // Methods Mol. Biol. – 2001. – V. 160. – P. 37-48.

4.                                                                              Ruiz-Carillo A., Cфtй J. Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G // Science. – 1993. – V. 261. – P. 765-769.

5.                                                                              Perret C.J. Iodometric assay of penicillinase // Nature (London). – 1954.-V. 174.-Р. 1012-1013.

6.                                                                              Barth P.T. et al. Copy number of coexisting plasmids in Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. – 1978. – V. 135. – P. 760-765.

7.                                                                              Dake E., Hoffman T. Purification and properties of the major nuclease from mitohondria of Saccharomyces cerevisiae // Biol. Chem. – 1988. – V. 263.-P. 7691-7702.