BioScience Blog – Научный Биологический блог

Разработка генных и генно-клеточных конструкций для лечения нейротравм, ишемических инсультов головного и спинного мозга, а также нейродегенеративных заболеваний является актуальной задачей современной медицины. В то же время остается открытым вопрос выбора наиболее эффективных терапевтических генов и их комбинаций. Целью работы является создание генных конструкций на основе двухкассетной экспрессионной плазмиды pBudCE 4.1, одновременно и независимо экспрессирующей два терапевтических гена FGF-2 и GDNF.

Фактор роста фибробластов FGF-2 (Fibroblast Growth Factor 2) контролирует ранний цитогенез многих клеточных типов, формируя в эмбриогенезе специальную сигнальную систему. Эта молекула является не только фактором роста, но и обладает выраженным нейротрофическим действием. Комбинированная терапия экспериментальной травмы спинного мозга путём трансплантации стволовых мезенхимных клеток человека и введения FGF-2 улучшало функциональные показатели нейрорегенерации [1]. При травме спинного мозга количество FGF-2+- клеток в нём возрастает в 15 раз [2], что свидетельствует об участии этого нейротрофического фактора в молекулярных и клеточных механизмах нейрорегенерации. Позитивное влияние FGF-2 связывают с угнетением экспрессии гена каспазы 3 и апоптоза клеток на стадии вторичной дегенерации, что в конечном итоге поддерживает регенерацию нервных волокон и восстановление функции спинного мозга. Подведение FGF-2 в область травмы спинного мозга приводит к существенному уменьшению объёма патологических полостей и более выраженной сохранности белого вещества.

Глиальный нейротрофический фактор GDNF (Glial cell Derived Neurotrophic Factor) принадлежит к семейству трансформирующего фактора роста бета (TGFв), секретируют клетки глии (астроциты, шванновские клетки), имеет выраженное нейропротекторное действие на дофаминэргические нейроны и мотонейроны спинного мозга, стимулирует рост аксона [3]. Уровень мРНК GDNF быстро возрастает при повреждении нервной системы [4]. Рецептор-опосредованный механизм доставки гена GDNF и его последующий ретроградный транспорт ованреализ на мотонейронах с выраженным эффектом уменьшения их посттравматической гибели. Трансплантация генетически модифицированных мезенхимных стволовых клеток, экспрессирующих GDNF, крысам с фенотипом бокового амиотрофического склероза увеличивает выживаемость мотонейронов. На модели травмы лицевого нерва показано, что применение биодеградируемого материала в комбинации с нейральными стволовыми клетками, генетически модифицированными для экспрессии GDNF, повышает регенерацию поврежденного нерва.

Амплификация человеческих генов FGF-2 и GDNF с использованием специфичных праймеров методом ОТ-ПЦР, созданных на основе нуклеотидных последовательностей данного гена из системы GeneBank. Продукты амплификации были клонированы в плазмиду pGEM-TEasy и просеквенированы. После этого нами было проведено субклонирование генов в экспрессионные плазмидные вектора pcDNА3.1+, pBudCE4.1.

В результате проведенных исследований создана генная конструкция на основе двухкассетной экспрессионной плазмиды pBudCE 4.1, одновременно и независимо экспрессирующей два терапевтических гена FGF-2 и GDNF для повышения эффективности доставки комбинаций терапевтических генов в клетки-мишени.

Литература

1. Kim D. S. et al. Pituitary Tumor Transforming Gene (PTTG) Stimulates Thyroid Cell Proliferation via a Vascular Endothelial Growth Factor/Kinase Insert Domain Receptor/Inhibitor of DNA Binding-3 Autocrine Pathway // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2006. – V. 91, № 11. – P. 4603-4611.

2. Xu L. et al. Human neural stem cell grafts ameliorate motor neuron disease in SOD-1 transgenic rats // Transplantation. – 2006. – V. 82, № 7. – P. 865-875.

3. Iannotti С. et al. A neuroprotective role of glial cell line-derived neurotrophic factor following moderate  spinal  cord contusion injury // Experimental Neurology. – 2004. V. 189, № 2. – P. 317-332.

4. Hoke A. et al. Expression of glial cell line-derived neurotrophic factor family of growth factors in peripheral nerve injury in rats // NeuroReport. – 2000. – V. 11.-P. 1651-1654.