BioScience Blog – Научный Биологический блог

PAF (platelet activating factor или фактор активации тромбоцитов) – фосфолипид, который играет большую роль в реакциях аллергии и воспаления. PAF действует через активацию GPCRs (G protein coupled receptors или ассоциированные с G белком рецепторы). Ранее считалось, что GPCRs являются мономерами. Но оказалось, что димеризация у таких рецепторов играет ключевую роль во многих роцессахп, включая трафик рецепторов по направлению к клеточной мембране и специфичность в передаче сигнала. PAFr (receptor of the platelet activating factor или рецептор фактора активации тромбоцитов), состоящий из семи трансмембранных доменов (TMDs) также относится к семейству GPCRs.

Цель данной работы — найти TMDs, ответственные за димеризацию у PAFr, а также определить сайты (аминокислоты) димеризации, для чего использовались такие методы, как молекулярное клонирование, точечный

мутагенез, FACS метод, BRET (bioluminescence energy transfer) анализ, in silico анализ.

Для обнаружения TMDs, участвующих в димеризации, каждый из TMDs по отдельности был заклонирован с HA-тэгом в экспрессионной плазмиде. Затем высокий уровень экспрессии всех семи TMDs в клеточной культуре человеческих фибробластов HEK 293 был определен по HA-тэгу с помощью FACS анализа и флуоресцентного микроскопа. Каждый TMD был протестирован в несколько подходов реакцией конкурентного ингибирования методом BRET. Идея данной реакции состоит в том, что при котрансфекции в клетки HEK 293 совместно с luc PAFr (донор) и GFP PAFr (акцептор) каждый TMD по отдельности может уменьшать (при участии данного домена в димеризации) или оставлять без изменения (если данный домен не критичен для димеризации) сигнал BRET по сравнению с положительным контролем сигнала BRET (котрансфекция только luc PAFr и GFP PAFr ДНК). Выявлено, что TMD3, TMD4 и TMD7 способны снижать сигнал BRET при котрансфекции с luc PAFr и GFP PAFr. Поэтому можно говорить о возможности участия этих трансмембранных доменов в димеризации PAF рецептора.

Также был использован анализ in silico для предсказания сайтов (аминокислот) димеризации. Такими сайтами по результатам анализа могут являться: в первом TMD – G34, в четвертом TMD – L139, W142, V143, Y151, I154, в пятом TMD — L197, L200, F204. С мощьюСпо точкового мутагенеза были получены двойные мутанты PAF рецептора — mycGFP PAFr G34W, L139W и mycGFP PAFr G34W, W142G. Высокий уровень экспрессии точечных мутантов в клетках HEK 293 по myc-тэгу был подтвержден FACS анализом. ДНК myc luc PAFr wt было котрансфецировано по отдельности с ДНК mycGFP PAFr G34W, L139W и mycGFP PAFr G34W, W142G в клетки HEK293 для проведения BRET анализа. Только в случае с mycGFP PAFr G34W, W142G сигнал BRET был в несколько раз ниже, чем в положительном контроле (GFP PAFr wt и   c PAFr wt).

В результате проведенных исследований можно сделать вывод о том, что аминокислота W142 участвует в процессе димеризации PAF рецептора.