Лукьянов М.М., Казанова Е.В. Взаимодействие фактора транскрипции NF-κB с синтетическими ДНК-дуплексами
Метод ковалентного связывания белка с синтетическим ДНК-дуплексом позволяет идентифицировать домен белка, и даже отдельные аминокислоты, взаимодействующие с заданным фрагментом ДНК в белково-нуклеиновом комплексе. Этот подход можно использовать для обнаружения белков в клеточных экстрактах, а также для разработки необратимых ингибиторов ДНК-связывающих белков.
Для ковалентного связывания остатков лизина с модифицированными олигонуклеотидными дуплексами было предложено новое соединение – 2′-О-(2,5-диоксо-3-азапентил)уридин, содержащее в составе углеводного фрагмента альдегидную группу [1]. В нашей работе были получены ДНК-дуплексы, несущие в своей структуре участок узнавания фактора транскрипции NF-кВ и содержащие это альдегидное производное уридина. На 3′-конец олигонуклеотидов был введён аминолинкер, защищающий их от действия клеточных экзонуклеаз. Исходными соединениями для синтеза альдегидных производных ДНК послужили олигонуклеотиды, несущие диольную группировку, которые также использовались для изучения комплексообразования с NF-kB.
Анализ методами ВЭЖХ и электрофореза в полиакриламидном геле показал гомогенность синтезированых олигонуклеотидов. Анализ продукта реакции с бис-гидразидом янтарной кислоты подтвердил наличие диольной группировки в олигонуклеотидах, содержащих модифицированный нуклеозид. Определение температуры плавления ДНК-дуплексов показало, что вводимые модификации существенно не сказываются на термической стабильности двойной спирали. Установлено, что введение 3′-концевого аминолинкера повышает устойчивость дуплексов к действию фосфодиэстеразы змеиного яда.
Исследование комплексообразования 2′-диол со держащих ДНК-дуплексов с гомодимером субъединицы р50 фактора транскрипции NF-ПВ продемонстрировало их эффективное связывание, однако аффинная модификация белка 2′-альдегидсодержащими лигандами протекала с низким выходом. Структура модифицированных дуплексов и их комплексов с NF-кВ была исследована методом молекулярной динамики.
Обнаружено, что фактор транскрипции NF-кВ связывается с ДНК-дуплексами, содержащими палиндромные участки, с тем же сродством, что и с сайтами специфического связывания этого фактора, и с большим сродством, чем с дуплексами с произвольной нуклеотидной последовательностью.
Литература
E.M. Zubin, D.A. Stetsenko, T.S. Zatsepin, M.J. Gait and T.S. Oretskaya (2005) Oligonucleotides containing 2′-O-[2-(2,3-dihydroxypropyl)amino-2-oxoethyl] uridine as suitable precursors of 2′-aldehyde oligonucleotides for chemoselective ligation // Bioorganic & Medical Chemistry, V. 13, P. 4912–4920.
Loading ...