BioScience Blog – Научный Биологический блог

«Кворум сенсингом» называют способность бактерий чувствовать плотность популяции и использовать эту информацию в регуляции активности генов. Медиатором этого процесса служит низкомолекулярное вещество – автоиндуктор. Автоиндуктор 2-го типа (АИ-2) синтезируется белком LuxS из S-рибозилгомоцистеина. На основе двухкомпонентной системы LuxPQ Vibrioharveyiбыл создан первый сенсор на АИ-2. Но эта двухкомпонентная система обнаружена только у рода Vibrio. Более распространена показанная на Salmonellaenthericaи Escherichiacolilsr-система: оперон lsrACDBFG, кодирующий белки транспорта и деградации АИ-2, и сопряженные с ним гены lsrK – киназы АИ-2 и lsrR – репрессора lsr-оперона, теряющего эту способность при связывании с открытой фосфорилированной формой АИ-2.

Для создания сенсора в
E. coliмы использовали промотор lsr-оперона и ген-репрессор lsrR. Фрагменты ДНК, несущие только промотор, а также промотор вместе с геном lsrR были клонированы в беспромоторный вектор pDEW201 (colEI репликон: 20-50 копий) несущий lux гены Photorhabdusluminescensв качестве репортёрных. Полученные конструкции были трансформированы в штамм E.coliMG1655 и изогенный ему E.coli MG1655 ΔluxS. Все 4 штамма были проверены на чувствительность к АИ-2. Для этого клеткам при OD=0,05 – 0,1 добавляли над осад очные культуры клеток E.coliMG1655 при OD=1,0 (количество АИ-2 при такой плотности максимально) и ночных культур (к этому моменту весь АИ-2 уже переработан). Значимый эффект наблюдали только в клетках с мутацией по luxS и геном lsrR в векторе: двукратное увеличение люминесценции. Предполагается, что значительную роль в регуляции lsr-оперона играет эффект дозы гена lsrR. Поэтому был сконструирован биосенсор с использованием вектора pMWFlux, который отличается от pDEW201 ориджином репликации (pSC репликон: 8-12 копий). В результате в аналогичном случае (штамм E.coliMG1655 ΔluxS с геном lsrR в векторе) было получено увеличение люминесценции более чем в 4 раза.