BioScience Blog – Научный Биологический блог

Автоиндуктор 2-го типа (АИ-2) является медиатором «кворум сенсинга» у бактерий Escherichiacoli. «Кворум сенсингом» называют способность бактерий чувствовать плотность популяции и использовать эту информацию в регуляции активности генов. АИ-2 конститутивно синтезируется белком LuxS из S-рибозилгомоцистеина и свободно выходит в окружающую среду. При достижении критической концентрации фосфорилируется киназой lsrK и вызывает дерепрессию lsr-оперона, связываясь с LsrR (репрессор lsr оперона). Оперон lsrACDBFG, кодирует белки транспорта и деградации АИ-2. За счёт такого механизма концентрация АИ-2 резко возрастет, что, как предполагается, ведёт к переключению регуляции многих генов, опосредуемой репрессором LsrR. К концу экспоненциальной фазы роста устанавливается равновесие между синтезом и распадом АИ-2: медиатор практически исчезает из среды.

Нашей первоочередной задачей было создание сенсора на АИ-2. Для создания сенсора в Е. coliмы использовали промотор lsr-оперона и ген-репрессор isrR. Фрагменты ДНК, несущие только промотор, а также промотор вместе с геном IsrRбыли вставлены в беспромоторные векторы pDEW201 (pBR322 репликон: 20-50 копий) и pMWFlux (pSC репликон: 8-12 копий), несущий lux гены Photorhabdusluminescensв качестве репортёрных. Полученные конструкции были трансформированы в штамы E.coliMG1655 и E.coliDH5a (не экспрессирует luxS). Все 4 штамма были проверены на чувствительность к АИ-2. Для этого клеткам при OD=0,05-0,1 добавляли надосадочные от клеток E.coliMG1655npn OD=1,5 (концентрация АИ-2 при такой плотности максимально) и E.coliDH5a (не образуют АИ-2). Практически никакого значимого эффекта при этом не наблюдалось: добавка АИ-2 не увеличивала активность промотора. Но следует отметить, что штаммы с дополнительным LsrR имели более низкую люциферазную активность в начале экспоненциальной фазы роста и более высокую в стационарной фазе, чем штаммы без дополнительного репрессора.

В надежде увеличить количество АИ-2 клонировали белок LuxS (осуществляет синтез АИ-2) в вектор pZE21 под промотор PLtetO-1. Добавление такой надосадочной в начале экспоненциального роста приводит к подавлению экспрессии промотра (в 2-3 раза), а если суперэкспрессировать LuxS в сенсорных штаммах, то наблюдается сильное снижение люциферазной активности (до 100 раз). Полученные данные дают основания считать, что нефосфорилированная форма АИ-2, связываясь с LsrR, способствует репрессии lsr оперона. В ближайшее время планируется проверить предположение на штаммах с делециями по luxSи lsrK.