BioScience Blog – Научный Биологический блог

Ядро любой эукариотической клетки – место синтеза РНК, обладающих различными функциями. Кодирующие РНК синтезируются из-под промотора полимеразы II, в то время как синтез некодирующих РНК направляется промоторами полимераз I и III и в ряде случаев промотором полимеразы П. Несмотря на то, что индивидуальные механизмы экспорта некоторых РНК изучены достаточно хорошо, взаимосвязь между различными механизмами экспорта РНК неясна. В данной работе мы исследовали некоторые процессы, происходящие в ходе экспорта РНК из ядра в клетках N. benthamiana— близкого родственника табака, широко применяющегося в растительной биотехнологии. Была выдвинута гипотеза, что тип промотора, его сродство к полимеразе определённого типа, определяет механизм сортировки и последующего экспорта РНК из ядра.

Был разработан оригинальный метод исследования экспорта РНК с помощью гиперэкспрессии коротких некодирующих РНК (КНР), синтезируемых под контролем промоторов полимераз I – III типов, соответственно, промотора рРНК (конструкция Pol IrRNA-KHP), 35S промотора вируса мозаики цветной капусты (Pol II35S-KHP) тРНК^ (Pol jjjtRNA-KHp^. Суть метода заключается в оценке способности синтезируемых КНР влиять на экспрессию репортёрных генов.

На первом этапе работы мы доказали с помощью конфокальной микроскопии, что КНР, синтезирующиеся под контролем промоторов всех трёх типов экспортируются в цитоплазму.

Было показано, что Pol II – КНР существенно подавляет экспрессию репортёрного гена (GFP), синтезирующегося из-под 35S промотора полимеразы II. При этом, различие в последовательностях КНР одинаковой длины не оказывало существенного влияния на описанный эффект: искусственная КНР (GAAA)i6 и природная U6 оказывали сходный эффект на экспрессию 35S-GFP. Более существенным фактором оказалась именно длина КНР. Её уменьшение приводило к снижению негативного эффекта на экспрессию маркерного гена. Наиболее вероятным объяснением этого, является то, что с ростом длины снижается экспрессия КНР, что было подтверждено анализом количества данной короткой РНК. С другой стороны, КНР, синтез которых направляется промоторами полимераз I и III – соответственно Pol IrRNA-KHP и Pol III^^-KHP – оказывают стимулирующий эффект на экспрессию репортёрного гена.

Полученные результаты чётко показывают, что только КНР, синтезируемые под контролем промотора полимеразы II конкурируют с мРНК. Конкуренция в данной системе может происходить на двух стадиях – транскрипции и экспорта. С помощью ПЦР с детекцией в реальном времени было показано, что количество РНК репортёрного гена не меняется в присутствии КНР, что ставит под сомнение идею о конкуренции за транскрипционные факторы. С другой стороны, с помощью конфокальной микроскопии было показано, что КНР, синтезированный из-под промотора полимеразы II(Pol II35S-(GAAA)i6), действительно ограничивает выход репортёрной матрицы из ядра. Таким образом, было показано, что РНК, синтезирующиеся под контролем промотора полимеразы II конкурируют за транспорт между собой, но не конкурируют с РНК, синтез которых направляется промоторами другого типа.

Таким образом, была разработана экспериментальная система для исследования экспорта РНК из ядра, и с её помощью охарактеризована конкуренция РНК, синтезирующихся под контролем промоторов различных типов.