BioScience Blog – Научный Биологический блог

Альдоксимы — это интермедиаты биосинтеза некоторых биологически активных веществ, таких как индолилуксусная кислота, цианогенный гликозид и глюкозинолаты в растениях. Так индолацетальдоксимгидролаза катализирует специфическую дегидратазную реакцию индолацетальдоксима в индолацетонитрил. Этот фермент можно обнаружить в некоторых родах грибов и высших растений, и впервые он выделен из Gibberella sp. [1]. У бактерий конверсия альдоксимов в нитрилы, а затем в соответствующие карбоновые кислоты происходит путем сочетания работы ферментов альдоксимдегидратазы и нитрилутилизирующих ферментов — нитрилгидратазы и амидазы и/или нитрилазы [2].

Данная работа посвящена детекции генов альдоксимдегидратаз у бактерий, способных утилизировать нитрилы карбоновых кислот.

Объектами исследования являлись бактериальные культуры, утилизирующие нитрилы карбоновых кислот, полученные ранее (2002-2004 гг. и 2006-2008 гг.) в результате селекции на ацето – или изобутиронитриле из образцов почв и вод естественной среды и почвы промышленных предприятий (ФГУП "ПЗ им. С.М. Кирова" и ОАО "Бератон"). Всего проанализирована 91 культура микроорганизмов: 59 штаммов грамположительных (роды Rhodococcus, Arthrobacter, Miсrobacterium, Citreobacterium, Nocardia, Gordonia, Aureobacterium) и 32 штамма грамотрицательных (роды Pseudomonas, Azomonas, Azotobacter
и Acidovorax) бактерий. Препараты хромосомной ДНК грамположительных микроорганизмов получали фенольным методом, модифицированным для выделения ДНК из актиномицетов (Гловер Д., 1988). Выделение тотальной ДНК для грамотрицательных проводили по методике, описанной G.G. Stone [3].

Детекцию генов альдоксимдегидратаз осуществляли посредством ПЦР с праймерами к генам, кодирующим известные альдоксимдегидратазы грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов (табл. 1).

Режим амплификации для всех праймеров включал начальный цикл денатурации — 1 мин при 94ºС и завершающий цикл 3 мин при 72ºС. Для праймеров RhOxd F1/R1 режим амплификации составлял: 94ºС — 20 с; 64ºС — 30 с; 72ºС – 60 с (35 циклов). Для праймеров PsOxd F1/R1: 94ºС – 20 с; 54ºС – 70 с; 72ºС – 60 с (35 циклов).

Установлено, что у 12 штаммов (20,3%) грамположительных нитрилутилизирующих бактерий присутствовали фрагменты ДНК, соответствующие по размеру гену альдоксимдегидратазы (рис. 1). Все штаммы принадлежали к роду Rhodococcus (из них 11 — R. erythropolis, 1 — R. rhodochrous). На матрице ДНК одного штамма из группы грамотрицательных микроорганизмов — Pseudomonas fluorescens 3220 — амплифицирована последовательность, соответствующая по размеру гену альдоксимдегидратазы P. chlororaphis B23 [4].

Таким образом, установлено, что только 13 из 91 штамма (14,3%) нитрилутилизирующих бактерий лабораторной коллекции содержали гены альдоксимдегидратаз.

Распределение нитрилгидролизующих ферментов в группах микроорганизмов и их физиологическая роль определена не в полной мере, поэтому изучение альдоксимдегидратаз, генетической регуляции альдоксим-нитрильного пути позволит понять механизмы отыраб этих ферментов и их место в метаболизме бактерий.

Работа выполнена при поддержке ВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010)».

Литература

1.                                         Asano Y. et al.
Fungal degradation of triacrylonitrile // Agric. Biol. Chem. – 1981. – V. 45. – P. 57-62.

2.                                                   Kato Y. et al. Isolation and characterization of a bacterium possessing a novel aldoxime-dehydration activity and nitrile-degrading enzymes // Arch. Microbiol. – 1998. – V. 170. – P. 85-90.

3.                                           Stone G.G. et al. Detection of Salmonella serovars from clinical samples by enrichment broth cultivation-PCR procedure // J. Clin. Microbiol. – 1994. – V. 32. – P. 1742-1749.

4.                                          Oinuma K. et al. Novel aldoxime dehydratase involved in carbon-nitrogen triple bond synthesis of  Pseudomonas chlororaphis B23 // J. Biol. Chem. – 2003. – V. 278. – P. 29600-29608.