BioScience Blog – Научный Биологический блог

Одним из проявлений полиморфизма геномной ДНК являются однонуклеотидные замены (SNP). В геноме человека SNP представлены в среднем через каждые 500 п.н. Это делает возможным использование SNP в качестве эффективного инструмента при выполнении ряда задач в ходе популяционных исследований, оценки степени предрасположенности к различным заболеваниям, предсказания индивидуальной чувствительности к лекарственным средствам, оценки молекулярной эволюции групп родственных генов. В связи с этим, наблюдается повышенный интерес к разработке метода, способного осуществить в короткий срок информативный, недорогой и качественный анализ полноразмерной геномной ДНК на предмет выявления специфических SNP.

Существует несколько направлений в разработке метода, способного удовлетворить определённым требованиям проведения скрининга образцов. Наиболее информативным в плане выявления и характеристики мутаций denovoявляется метод автоматического секвенирования. Однако секвенирование протяжённых фрагментов ДНК является достаточной дорогой и трудоёмкой процедурой. Широко используются быстрые методы скрининга, которые полагаются на один из двух принципов. Первая группа методов использует конформационные различия в гетерогенных фрагментах ДНК, которые приводят к изменению электрофоретической подвижности образца (SSCP, DGGE). Однако данные методики не дают информации относительно природы или местоположения мутации. Вторая группа методов основывается на способности белков узнавать участок ДНК с ошибочно спаренными нуклеотидами, что обеспечивает исследователя информацией о местоположении мутации. В последние годы в разработке ферментативных методов детекции мутаций используются бактериофаговые резолвазы. Несмотря на то, что основной биологической функцией резолваз является разрешение структур Холлидея в процессе рекомбинации, они способны специфически узнавать и связываться с участками дуплексной ДНК, где не произошло спаривание нуклеотидов в силу отсутствия комплементарности между последними.

Нами клонирован и секвенирован ген эндонуклеазы I бактериофага Т7 в векторе pKRX, который впоследствии был переклонирован в экспрессирующие векторные конструкции рЕТ-За, PinPoint Ха-2 и рЕТ-44Ь в нужной ориентации и с сохранением рамки считывания, что было подтверждено секвенированием. В ходе дальнейшей работы необходимо получить при помощи изменения состава реакционной смеси или сайт-направленного мутагенеза дефектный по каталитической функции белок Т7Е1. Такой дефектный Т7Е1 способен узнавать и связываться с неспаренными нуклеотидами гетеродуплексной ДНК с прежней специфичностью, но последующего расщепления мисмэтча происходить не будет. К каталитически неактивному белку путём иммунизации будут получены кроличьи антитела, с которыми будут взаимодействовать вторичные антикроличьи антитела, меченные стрептавидином и магнитными частицами, несущими биотиновую метку. В результате, полученный белковый комплекс будет способен присоединяться к гетеродуплексам ДНК, содержащим мисмэтчи, и не разрушать их, а благодаря магнитным частицам данный ДНК-белковый комплекс возможно без труда отделить от остальной массы дуплексных молекул с целью дальнейшего секвенирования конкретных фрагментов ДНК. Такой подход будет особенно ценен при изучении однонуклеотидного полиморфизма ДНК близнецов.