BioScience Blog – Научный Биологический блог

В последнее время исследователи все чаще направляют свое внимание на использование в составе иммуногенов адъювантов, активирующих врожденный иммунный ответ. Одним из таких иммуномодуляторов является белок флагеллин, основной структурный компонент бактериальной флагеллы. Так, флагеллин Salmonellatyphimuriumбыл успешно применен в качестве адъюванта в таких лабораторных моделях как F1/V антиген Yersiniapestis(возбудитель чумы), 4хМ2е-антиген (4 слитых эпитопа из белка М2 вируса гриппа), белок Sp-1 мерозоита Plasmodiumvivax(возбудитель малярии) и др. Представляется перспективным использовать рекомбинантный флагеллин, как адъювант при создании иммуногенов против Mycobacteriumtuberculosisи ВИЧ-1 субтипа А. Для этого необходимо создать штамм Е. coli, продуцент рекомбинантного белка FHC (флагеллина S. typhymurium) и получить очищенный препарат данного белка.

Ген, кодирующий белок FHC, был амплифицирован с использованием в качестве матрицы геномной ДНК аттенуированного штамма S. typhimurium T10. Амплифицированный ген был клонирован в экспрессионной плазмиде рЕТ151. Полученной плазмидой трансформировали клетки Е. coliштамма BL21[DE3] Star.

Была проведена оптимизация экспрессии рекомбинантного белка FHC в клетках Е. coli, при этом варьировали 3 параметра: тип индуктора (0.2% лактоза и 1мМ ИПТГ), время индукции (1-7 часов при индукции экспрессии ИПТГ и 16-20 часов при индукции лактозой), а также температура ферментации бактерий (25°С;30°С;37°С). В результате, было показано, что максимальный уровень экспрессии при использовании более дешевого индуктора – лактозы (37+/-1% от общего клеточного белка после 16 часов индукции 0.2% лактозой) не отличался от уровня экспрессии при использовании ИПТГ (39+/-1% от общего клеточного белка после 4 часов индукции 1мМ ИПТГ). При этом при использовании в качестве индуктора 0.2% лактозы кроме индукции происходит значительный прирост биомассы клеток, что практически не наблюдается при индукции 1мМ ИПТГ. Также прирост биомассы наблюдается при пониженной температуре ферментации бактерий – 25°С. Полученный рекомбинантный белок FHC на 88+/-1.5% находится в клетках штамма-продуцента в растворимом виде и только 12+/-1.5% процент приходится на нерастворимую фракцию – тельца включения. С использованием иммобилизованной металлоаффинной хроматографии был получен препарат флагеллина S. typhimuriumс чистотой 95+/-2%, который можно использовать при проведении иммунологических экспериментов.