BioScience Blog – Научный Биологический блог

В последнее время большое внимание уделяется исследованию функционирования различных метаболических систем клетки при патологиях, сопряженных с интенсификацией свободнорадикальных процессов. Функционирование ферментов центрального метаболизма в данных условиях недостаточно изучено. В связи с этим привлекает интерес исследование свойств НАД-зависимой малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37; НАД-МДГ), катализирующей обратимое превращение малата в оксалоацетат, в условиях экспериментального токсического гепатита (ЭТГ). Имеются данные о значительной роли субстрата МДГ – малата, в биохимической адаптации организма к гипоксии [1], а также его участии в транспорте низкомолекулярного антиоксиданта — цитрата, через биологические мембраны [2]. В связи с вышесказанным была проведена очистка и исследованы некоторые кинетические характеристики НАД-МДГ из митохондриальной (мМДГ) и цитоплазматической (цМДГ) фракций гепатоцитов крыс в норме и при ЭТГ.

Выделение и очистку НАД-МДГ осуществляли по схеме, включающей гомогенизацию ткани печени, дифференциальное центрифугирование, гель-фильтрацию на сефадексе G-25 и Тойоперл HW-65, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Активность фермента определяли спектрофотометрически при 340 нм в среде 50 мМ трис-HCl буфера рН 8,6 (для мМДГ) и рН 8,3 (для цМДГ), содержащего 0,2 мМ оксалоацетат (ОА), 0,15 мМ НАДН.

С помощью разработанной схемы очистки получены очищенные в 66,7 и 74,2 раза препараты мМДГ с удельной активностью 47,0±2,4 и 45,5±2,3 Е/мг белка и очищенные в 77,7 и 82,9 раза ферментные препараты цМДГ с удельной активностью 75,2±3,7 и 75,9±3,7 Е/мг белка из гепатоцитов крыс в норме и при ЭТГ соответственно. Выход составил 16,7 и 19,0% для митохондриальной и 26,0% и 26,7% для цитоплазматической НАД-МДГ из нормальной и пораженной ССl4 печени. С использованием полученных очищенных препаратов проведено исследование влияние температуры на активность НАД-МДГ из митохондриальной и цитоплазматической фракций гепатоцитов крыс в норме и при патологии.

Проведенные исследования зависимости скорости реакции, катализируемой мМДГ, от температуры показали, что как в норме, так и при ЭТГ оптимальной является температура 45°С. Наибольшая активность фермента из цитоплазматической фракции определяется при температуре 50°С. Согласно полученным результатам, величины констант

инактивации фермента при температурах 30, 40, 50, 55 и 60°С и энергии активации при ЭТГ также не имеют достоверных отличий от контрольных значений. Так, Е^ мМДГ в норме составляет 3157±125 Дж, при гепатите 3262±134 Дж. Значение Е^ цМДГ составило 2816±112 Дж и 2880±115 Дж из гепатоцитов контрольной и опытной групп крыс соответственно.

Таким образом, согласно полученным данным, при оксидативном стрессе, вызванном введением гепатотоксина, величины температурного оптимума, констант инактивации и энергии активации НАД-МДГ из митохондриальной и цитоплазматической фракций клеток печени не имеют достоверных различий с нормальными значениями.

Литература

1. Глотов Н.А., Шмелева Л.Т. Влияние гипоксии и глютаминовой кислоты на содержание кетокислот в миокарде и почках крыс // Укр. биохим. журн. – 1973. – Вып. 5. – С. 605-608.

2. Robinson B.H., Olei J. Citrate transport in guinea pig heart mitochondria // Biochem. – 1975. – V. 53, № 5. – P. 643-664.