BioScience Blog – Научный Биологический блог

Протеасома – это мультисубъединичный комплекс, который играет ключевую роль в расщеплении большинства клеточных белков. В последнее время были обнаружены и некоторые неканонические роли протеасом – их участие в регуляции транскрипции и способность к расщеплению РНК. Исследование специфичности РНКазной активности показало преимущественное расщепление AU-богатых участков. Кроме того, стали известны две субъединицы циттоплазматических протеасом, предположительно отвечающие за РНКазную активность, – al и а5.

Целью данной работы было идентифицировать ранее неизвестные а-субъединицы протеасом, способные расщеплять РНК, а также исследовать изменения, происходящие в них после индукции апоптоза в клетках К562 ДНК-повреждающим агентом – доксорубицином. Субъединицы протеасом, выделенных из цитоплазмы и из ядер клеток К562, были разделены с помощью двумерного электрофореза. Из пятен, соответствующих по молекулярным массам a-субъединицами протеасом, были экстрагированы белки, которые в дальнейшем исследовались на наличие РНКазной активности в различных условиях: в отсутствие двухвалентных катионов и при наличии в реакционной среде ЮмМ Mg2+ или ЮмМ Са2+. В качестве субстрата использовалась мРНК р53, полученная с помощью транскрипции in vitro в присутствии радиоактивно меченного СТР. 5 субъединиц a-типа из цитоплазматических протеасом оказались способными расщеплять РНК, причём их активности усиливались в присутствии ионов кальция. Среди субъединиц протеасом из ядер клеток К562 только две – а7 и а5 – оказались способными расщеплять РНК. При этом субъединица а7 была наиболее активна в присутствии Mg2+. Для исследования регуляции РНКазной активности протеасом при индукции апоптоза, протеасомы были выделены цитоплазмы и из ядер клеток, обработанных доксорубицином. Субъединицы протеасом были разделены с помощью двумерного электрофореза, из пятен, соответствующих по молекулярным массам a-субъединицам, экстрагировались белки, которые затем исследовались на наличие РНКазной активности по отношению к радиоактивно меченной мРНК р53 присутствии и отсутствие двухвалентных катионов (Mg2+ и Са2+). После обработки клеток доксорубицином всего 4 субъединицы сохранили способность к расщеплению РНК: аб потеряла свою активность. Кроме того, наблюдались изменения в воздействиях двухвалентных катионов на активность практически всех субъединиц. Экстракты всех исследуемых пятен были также изучены с помощью масс-спектрометрии с целью идентификации содержащихся в них белков и посттрансляционных модификаций, способных влиять на РНКазную активность.