BioScience Blog – Научный Биологический блог

Количество выделенных и изученных внутриклеточных протеолитических ферментов, по отношению к экстрацеллюлярным протеиназам, несравнимо мало. В первую очередь, это связано со сложностью разрушения клеточной стенки бацилл, а также с меньшей стабильностью внутриклеточных белков. Был подобран оптимальный метод разрушения клеток Bacillusintermedius3-19 с целью получения максимального количества внутриклеточных белков. Было проведено сравнение трёх методов разрушения клеток бацилл: механическое растирание с абразивом, ферментативное разрушение (обработка лизоцимом), воздействие ультразвука. Культуру В. intermediusвыращивали на жидкой среде в течение 16 ч, после чего клетки осаждали центрифугированием и отмывали от культуральной жидкости 0,8% раствором NaCl. Для ферментативного разрушения клеточную массу смешивали в соотношении 1:3 с буферным раствором Tris-HCl (0,015 М, рН 7,5), содержащим 0,3% КС1 и лизоцим (2 мг/мл). Полученную смесь инкубировали в течении 30 мин. при 37°С, после чего центрифугировали 15 мин. при 10 тыс. об/мин. Количество внутриклеточных белков в супернатанте составило 2,62 мг/мл. Микроскопирование осадка показало наличие неразрушенных протопластов. По-видимому, лизоцим не оказывает влияния на цитоплазматическую мембрану клеток, что не позволяет внутриклеточным белкам перейти в раствор. Данный метод необходимо сочетать с механической или ультразвуковой обработкой. Растирание клеток проводили, смешивая клеточную массу в соотношении 1:1 с буферным раствором Tris-HCl (0,015 М, рН 7,5), содержащим 0,3% КС1, и добавляя абразив. После обработки смесь центрифугировали. Содержание белка в супернатанте – 5 мг/мл. Недостатками метода являются высокая трудоемкость и длительность обработки. Воздействию ультразвука подвергали суспензию клеток (10%) в буферном растворе Tris-HCl (0,01M). Буфер варьировал по значениям рН (8,0 и 9,0), а также содержанию лизоцима (0 и 1 мг/мл). Обработку проводили в течение 1 мин. Наиболее полное разрушение клеток (количество экстрагированного белка – 19,1 мг/мл) наблюдалось в условиях рН8,0 и в присутствии лизоцима. Увеличение времени ультразвукового воздействия приводило к снижению количества белка в клеточном экстракте.