Направленная инактивация детерминант потенциальных факторов патогенности Erwinia carotovora subsp. atroseptica
Скобляков С.А., Дементей А.Ю., Мямин В.Е., Песнякевич А.Г.
Erwiniacarotovorasubsp. atroseptica (Eca) — фитопатоген, поражающий побеги и клубни картофеля, что приводит к развитию заболевания "черная ножка" и мягкой гнили клубней, соответственно. Основными факторами патогенности Еса являются экзоферменты, разрушающих компоненты клеточной стенки растительной клетки (пектиназы, целлюлазы, протеазы). Спектр продуцируемых Еса экзоферментов в настоящее время изучен недостаточно.
Проведенный нами анализ генома Еса SCRI1043, выявил ряд кодирующих последовательностей (КП), гомологичных генам охарактеризованных у Еса экзоферментов. Среди них: ЕСА0804 (гомологична гену рамногалактуронатлиазы Erwiniachrysanthemi), ECA0852 (гомологична гену арабиногалактан эндо-1,4-0-галактозидазы Pseudomonasfluorescens) и ЕСА 1873 (гомологична гену ксиланазы Shigellaflexneri).
С целью изучения роли перечисленных КП в патологическом процессе, нами созданы генетические конструкции для их направленной инактивации. Для этого осуществлена амплификация соответствующих фрагментов хромосомной ДНК Еса SCRI1043, и клонирование ПЦР-продуктов в векторе pUC18 (в результате получены плазмиды pRGl, pAGl, pGHl, соответственно). После инсерции в последовательность клонированных фрагментов кассеты антибиотикорезистентности "омега" (плазмиды pRG2, pAG2, pGH2), полученные конструкции переклонировали в мобилизуемый суицидный вектор pJQ200SK (pRG3, pAG3, pGH3, соответственно). Эти плазмиды были введены в клетки Е. coliBW19851, которые затем были использованы в качестве доноров в конъюгационных скрещиваниях с бактериями Еса SP234 (спонтанный мутант Еса SCRI1043 устойчивый к рифампицину). В настоящее время проводится рекомбинационная замена интактных КП на мутантные.
Литература
1. Barras F., Gijsegem F., Chatterjee A. (1994) Extracellular enzymes and pathogenesis of soft-rot Erwinia // Annu. Rev. Phytopathol., Vol.32, p.201-234.
2. Quandt J., Hynes M. (1993) Versatile suicide vectors which allow direct selection for gene replacement in Gram-negative bacteria // Gene, Vol.127, p. 15-21.
3. Toth I.K., Bell K.S., Holeva M.C., Birch P.R. (2003) Soft rot erwiniae: from genes to genomes // Molecular Plant Pathology, Vol.4, p. 17-30.
Loading ...