BioScience Blog – Научный Биологический блог

НАД+-зависимая формиатдегидрогеназа (ФДГ) является перспективным ферментом для регенерации кофактора НАДH в промышленных масштабах. Кроме того, реакция окисления формиата, катализируемая ФДГ, служит простейшей моделью для изучения процесса переноса гидрид-иона дегидрогеназами.

Интересной особенностью ФДГ является наличие двух каналов, связывающих глубоко погруженный в белковую глобулу активный центр с поверхностью: широкий коферментный канал, являющийся площадкой для связывания НАД+, и более узкий субстратный канал. В отсутствии кофермента оба канала могут служить для транспорта формиата. После связывания НАД+ формиат может проникнуть в активный центр через субстратный канал. Благодаря наличию субстратного канала, связывание субстрата и кофермента у прокариотических ФДГ происходит неупорядоченным образом.

Данная работа выполнена с целью качественно охарактеризовать путь формиата через субстратный канал в ФДГ из бактерии Pseudomonas. Дополнительный интерес в этом ферменте представляет С-концевая петля Asn385-Ala393. Кристаллографические данные свидетельствуют о способности петли прикрывать внешнее горлышко субстратного канала после образования тройного комплекса ФДГ-НАД+-формиат.

Основой для исследования послужила кристаллографическая структура апо-формы фермента (PDB код 2nac). Использовался метод молекулярной динамики в явно заданном растворителе, а также метод управляемой динамики. Прежде всего была рассчитана траектория свободного фермента длиной 15 нс. Показана устойчивость конформации остатков активного центра. Продемонстрировано открывание внутреннего горлышка субстратного канала. Уточнены геометрические параметры субстратного канала. Показано, что в апоферменте С-концевая петля характеризуется высокой подвижностью и не препятствует транспорту формиата через субстратный канал. Затем был проведен докинг

формиата в активный центр фермента, после чего рассчитана дополнительная траектория длиной 6 нс. Полученная структура использовалась для моделирования транспорта формиата через субстратный канал к поверхности белка. Для этого к субстрату прикладывалась внешняя сила, направленная вдоль просвета канала. В результате были описаны взаимодействия формиата с остатками канала, возникающие по ходу диссоциации. Показано, что остаток активного центра Arg284 играет особую роль в связывании и диссоциации субстрата.

Полученные результаты и разработанная методика должны позволить в дальнейшем получить профиль свободной энергии для транспорта формиата и уточнить роль субстратного канала в функционировании фермента.