BioScience Blog – Научный Биологический блог

В настоящее время актинобактерии широко используются для осуществления регио – и стереоселективных превращений стеролов животного (холестерола) и растительного (β-ситостерола, в частности) происхождения. Показано [1,2], что актинобактерии рода Rhodococcus

проявляют выраженную холестеролоксидазную активность в отношении β-ситостерола. Образующийся продукт стигмаст-4-ен-3-он перспективен в качестве эффективного лекарственного средства при лечении эндокринных заболеваний [3]. Цель настоящей работы — подбор оптимальных условий направленного синтеза стигмаст-4-ен-3-она клетками алканотрофных родококков.

В работе использовали штаммы R. erythropolis и R. ruber из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур 768, www.iegm.ru/iegmcol). Клетки родококков выращивали в соокислительных условиях в жидкой минеральной среде, содержащей 0,1 об. % н-гексадекана. Стеролы (холестерол, β-ситостерол) в концентрации 0,5 г/л добавляли в питательную среду одновременно с инокулятом или через 2-е сут роста бактериальных клеток. В качестве индуктора холестеролоксидазной активности родококков использовали пальмитиновую кислоту (0,019-0,195 мМ). Содержание 4-ен-3-оновых продуктов (холест-4-ен-3-она, стигмаст-4-ен-3-она) в культуральной среде определяли методами УФ спектроскопии с помощью спектрофотометра Lambda EZ201 (Perkin-Elmer, США) и хромато-масс-спектрометрии с помощью газового хроматографа Agilent 6890N (Agilent technology, США). Эксперименты проводили в 3-х-кратной повторности.

Как видно из рис. 1, исследуемые штаммы родококков проявляют различную холестеролоксидазную активность в отношении β-ситостерола. Так, по данным хромато-масс-спектрометрии, представители R.
erythropolis осуществляют практически лнуюпо (95-100 %) конверсию холестерола в холест-4-ен-3-он. В то время как культуры R. ruber характеризуются наиболее выраженной активностью в отношении β-ситостерола и катализируют при этом образование от 50 до 75 % стигмаст-4-ен-3-она. Следует отметить, что оптимальный уровень стигмаст-4-ен-3-она регистрируется в условиях внесения стерола через 2 сут роста бактериальных клеток в присутствии    ексадеканан-г.

Для повышения β-ситостеролтрансформирующей активности родококков в качестве индукторов холестеролоксидазы использовали пальмитиновую кислоту. По данным УФ спектроскопии, максимальная (80,7 %) степень аккумуляции стигмаст-4-ен-3-она регистрируется при добавлении в ростовую среду 0,058 мМ пальмитиновой кислоты (рис. 2). При этом необходимо отметить, что оптимальный уровень биоконверсии β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он достигается в ияхвусло внесения стерола, индуктора в жидкую минеральную среду в первые часы роста родококков. Это позволяет сократить продолжительность процесса биотрансформации стерола с 7 до 5 сут.

Результаты исследований ряда авторов [4, 5], проведенных с использованием бактерий различных родов, свидетельствуют о том, что эффективность холестеролоксидазной реакции в отношении β-ситостерола, как правило, на 30-40 % ниже таковой в отношении холестерола. Нами впервые показано, что субстратная специфичность холестеролоксидазы актинобактерий R. ruber в 2 раза выше при окислении β-ситостерола. Таким образом, в ходе проведенных исследований обоснована возможность оптимизации процесса получения фармакологически активного стигмаст-4-ен-3-она с использованием клеток алканотрофных родококков.

Работа   выполнена   в   рамках Программы   фундаментальных исследований   РАН   «Биологическое                                                      разнообразие»   и   Программы междисциплинарных  фундаментальных исследований,  выполняемых  в учреждениях УрО РАН.

Литература

1.                                    Ившина И.Б. и др. Биотрансформация β-ситостерола и сложных эфиров  β-ситостерола актинобактериями рода Rhodococcus // Прикл. биохим. и микробиол. – 2005. – Т. 41, № 6. – С. 626-633.

2.                                    Гришко В.В. и др. Биокаталитическое получение физиологически активных соединений на основе растительного β-ситостерола // Катализ в промышленности. – 2009. – № 1. – С. 67-74

3.                                    Patent 5264428 USA. Use stigmasta-4-en-3-on in the treatment of androgen dependent disease / S. Streber-23.11.1993.

4.                                    Malaviya A.
et al. Androstenedione production by biotransformation of phytosterols // Bioresour. Technol. – 2008. – V. 99. – P. 6725-6737.

5.                                    MacLachlan J. et al. Cholesterol oxidase: sources, physical properties and analytical applications // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. – 2000. – V. 72. – P. 169-195.