BioScience Blog – Научный Биологический блог

Врастениях ингибиторы протеолитических ферментов, в том числе сериновых протеаз, выполняют целый ряд жизненно-важных функций, таких как регуляция активности эндогенных ферментов и защита от патогенов и растительноядных животных. Представляется перспективным использование ингибиторов протеаз в биотехнологии растений с целью получения устойчивых к болезням и вредителям сельскохозяйственных культур.

Ранее из семян гречихи Fagopyrumesculentumметодами экстракции и ионообменной хроматографии были получены компоненты, обладающие ингибиторной активностью в отношении ряда сериновых протеаз. В рамках настоящей работы методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) был очищен пептид BWI-2c, ингибирующий бычий трипсин. С использованием методов N-концевого секвенирования по Эдману, масс-спектрометрии и селективной фрагментации полипептидной цепи по остаткам метионина установлена полная аминокислотная последовательность BWI-2c из 41 аминокислотного остатка. Этот пептид относится к новому семейству ингибиторов сериновых протеаз, наиболее характерная черта которых – наличие четырех консервативных остатков цистеина, образующих две внутримолекулярные дисульфидные связи. Гомологами BWI-2c являются ингибиторы трипсина BWI-2a и 2b, также выделенные из семян гречихи. Кроме того, обнаруживается сходство аминокислотной последовательности BWI-2c с рядом пептидов растительного происхождения, выполняющих различные функции.

Для проведения всесторонних структурно-функциональных исследований нового ингибитора был разработан метод получения его рекомбинантного аналога в бактериальной системе экспрессии. Был синтезирован ген BWI-2c и сконструирован вектор, кодирующий пептид в составе химерного белка с тиоредоксином. Гибридный белок также содержал последовательность, обеспечивающую возможность выделения с помощью аффинной хроматографии и сайт для селективного расщепления энтерокиназой. Получен штамм Escherichiacoli— продуцент химерного белка, индукция экспрессии соответствующего гена осуществлялась добавлением в среду изопропил-β-D-тиогалактопиранозида. Очищенный методом аффинной хроматографии белок подвергался ферментативному гидролизу, целевой пептид выделялся методом ОФ-ВЭЖХ, выход составил 5 мг BWI-2c с литра бактериальной культуры. По данным N-концевого секвенирования, масс-спектрометрии и ОФ-ВЭЖХ рекомбинантный пептид эквивалентен природному. Анализ активности в отношении бычьего трипсина также подтвердил его соответствие нативному BWI-2c.

Результатом работы служит расширение ассортимента известных ингибиторов сериновых протеаз. Предполагается использование рекомбинантного пептида BWI-2c для установления его пространственной структуры.