BioScience Blog – Научный Биологический блог

Компенсация дозы генов у самок высших млекопитающих происходит за счёт транскрипционной инактивации одной из двух Х-хромосом. Инактивация Х-хромосомы – это сложный многостадийный процесс, начинающийся в раннем эмбриогенезе и контролируемый определённым генетическим локусом – Xic (X-chromosome inactivation center). Ген Xist (Xinactivatespecifictranscript) является ключевым фактором в инициации инактивации. Он экспрессируется только на неактивной Х-хромосоме и кодирует гигантскую, (размером более 17 т.н.) нетранслируемую, ядерную РНК, которая, распространяясь по Х-хромосоме, приводит к транскрипционному молчанию расположенных в ней генов.

В данной работе исследована регуляторная область гена Xistполевки Micmtusmssiaemeridionalis. В результате анализа 5" области гена Xistу семи видов млекопитающих, были обнаружены два наиболее консервативных района. Первый, размером около 100 п.н. (ECR1 – evolution conservative region) соответствует району минимального промотора и второй, размером 80 п.н. (ECR2) располагается в области от – 480 п.н. до – 400 п.н. относительно точки старта транскрипции у полевки. Для определения ДНК-мотивов, с которыми взаимодействуют регуляторные белки, данные районы были исследованы при помощи метода in vitro фугпринтинга с ДНКазой I. В реакциях связывания использовался радиоактивно меченый ДНК-зонд и ядерные белковые экстракты, выделенные из перевиваемой клеточной культуры фибробластов линии SD10. В результате в ECR1 было обнаружено девять защищенных районов на "+" цепи и шесть на "-" цепи. В ECR2 на "+" цепи были выявлены шесть защищенных районов.

Для поиска потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов была использована программа Matlnspector (www.genomatix.de). В результате в ECR1 обнаружены потенциальные сайты связывания таких широко распространенных транскрипционных факторов как ТВР, YY1, SP1, СААТ box связывающего фактора и других. В ECR2 выявлены потенциальные сайты связывания факторов: SRY, ER, RAR, API и других. Часть из обнаруженных сайтов практически полностью перекрывается с защищенными районами определенными в экспериментах по футпринтингу

Чтобы определить какое влияние на экспрессию TemXistоказывает ECR2 и выявить другие функциональные районы, были построены репортерные конструкции. Различные части 5" области гена Xistполевки были амплифицированы при помощи ПНР с праймерами, содержащими сайты рестрикции, и клонированы в вектор pGL4.10[luc2], содержащий ген люциферазы без собственного промотора Активность полученных конструкций исследована в клеточной линии SD10, которая представляет собой перевиваемую клеточную культуру фибробластов самки (XX). Показано, что минимальный промотор гена
Xistу полевки локализуется в районе от – 100 п.н. до +67 п.н.. Также, в 5Л области в районе от -100 п.н. до – 200 п.н. и от – 300 п.н. до – 400 п.н. могут располагаться репрессоры, а в районах от – 200 п.н. до – 300 п.н. и от – 400 п.н. до – 500 п.н. могут располагаться активаторы транскрипции.