BioScience Blog – Научный Биологический блог

Феномен генерации потенциалов у растений в качестве первичных реакций, индуцирующих адаптивный ответ растения на действие раздражителя, был установлен достаточно давно. Однако механизм генерации потенциала действия (ПД) и вариабельного потенциала (ВП) остается малоизученным [1, 2]. Имеется сходство в механизмах ациигенер ПД у животных и растений — формирование ПД связано с резким увеличением проницаемости мембраны и возникновением пассивных потоков ионов [1, 2]. В то же время имеются основания полагать, что в генерации ПД и ВП у высших растений принимает непосредственное участие электрогенный насос — Н+-АТФаза плазматических мембран [3,4].

Цель настоящей работы — изучение участия электрогенного насоса в процессе генерации потенциалов возбуждения у растений. При этом, если Н+-АТФаза участвует в данном процессе, то должно происходить изменение внутри – и внеклеточного pH.

Объектом исследования служили 3-4 недельные проростки тыквы Cucurbita pepo L. Изменения pH апопласта регистрировали с помощью зонда FITC-dextran [5], максимум возбуждения и флуоресценции которого составляет 493 и 520 нм соответственно. Увеличение интенсивности флуоресценции (Iфл) соответствует изменению pH в щелочную сторону. Для загрузки растения зондом, стебли проростков погружали в раствор, содержащий 510~8 М FITC-dextran на 12-18 часов. Регистрацию флуоресценции осуществляли на комплексе лазерной сканирующей микроскопии (микроскоп Axiovert 200M, лазерный сканирующий модуль Carl Zeiss LSM 510, спектральный модуль Carl Zeiss 23 META) и на спектрофлуорофотометре SHIMADZU RF-5301PC. Одновременно с регистрацией флуоресценции осуществляли запись электрической активности с помощью макроэлектродов. ПД индуцировали нанесением капли ледяной воды в нескольких сантиметрах акропитальнее зоны регистрации флуоресценции, ВП индуцировали ожогом семядольного листа на значительном расстоянии от зоны регистрации флуоресценции.

На первом этапе определяли локализацию зонда FITC-dextran в интактном растении. С помощью конфокальной микроскопии получали 3D изображения внутренней структуры загруженных зондом растений, из которых видно, что FITC-dextran избирательно накапливается в апопласте.

Одной из проблем применения флуоресцентной микроскопии в исследованиях на клетках растений является их автофлуоресценция в широком диапазоне длин волн. В связи с этим для корректной оценки полученных на LSCM изображений проводили их спектральный анализ. Были зарегистрированы спектры флуоресценции раствора FITC-dextran и растений, незагруженных и загруженных зондом. Сравнение полученных

спектров показало, что только у загруженных растений имеется максимум флуоресценции, аналогичный максимуму раствора FITC-dextran.

Искусственное изменение pH апопласта с помощью буферных растворов с различными значениями pH показало, что закисление апопласта ведет к снижению интенсивности флуоресценции. Таким образом показана возможность регистрации изменений внеклеточного pH на интактных растениях с применением данного зонда.

В дальнейшем определяли изменения pH при генерации электрических реакций. Обнаружено, что генерация ПД сопровождалась переходным увеличением интенсивности флуоресценции зонда FITC-dextran, что указывает на защелачивание апопласта. При генерации ВП также регистрировали переходное защелачивание апопласта, но более длительное во времени.

Полученные результаты указывают на следующую последовательность событий. На фазе деполяризации протоны входят в клетки из апопласта, о чем свидетельствует его временное защелачивание. На фазе реполяризации транспорт протонов направлен из клетки в апопласт. Такой трансмембранный перенос H+ может иметь место при переходном изменении активности H+-насоса плазматических мембран — инактивация на фазе деполяризации сменяется последующей активацией на фазе реполяризации электрических импульсов. Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что генерация потенциалов возбуждения у высших растений непосредственно связана с обратимым изменением активности электрогенного насоса (H+-АТФазы) плазматической мембраны возбудимых клеток.

Литература

1.                                                                               Опритов В.А. и др. Биоэлектрогенез у высших растений. — М.: Наука, 1991.-216 с.

2.                                                                              Davies E. Electrical signals in plants: facts and hypotheses // Plant Electrophysiology Theory and Methods. – Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2006.-P. 407-422.

3.                                                                               Опритов В.А. и др. Непосредственное сопряжение генерации потенциала действия в клетках высшего растения Cucurbita pepo L. с работой электрогенного насоса // Физиол. раст. – 2002. – Т. 46. – С. 160-165.

4.                                                                              Воденеев В.А. и др.     ратимоедр.Об изменение внеклеточного pH при генерации потенциала действия у высшего растения Cucurbita pepo // Физиол. раст. – 2006. – Т. 53, № 4. – С. 583-545.

5.                                                                              Hedrich R. et al. Changes in apoplastic pH and membrane potential in leaves in relation to stomatal responses to CO2, malate, abscisic acid or interruption of water supply // Planta. – 2001. – V. 213. – P. 594-601.