BioScience Blog – Научный Биологический блог

Внастоящее время в связи с загрязнения окружающей среды, распространением курения и вхождением в нашу жизнь различных синтетических пищевых добавок, лекарственных препаратов и т.д. происходит увеличение заболеваемости различными аллергическими заболеваниями, в том числе астмой и аллергическим дерматитом. Ген NRF2 ,играющий важную роль в регуляции системы чужеродных соединений, исследуется в качестве кандидатного в формировании предрасположенности к астме. Целью данного исследования явилось изучение частот встречаемости полиморфизмов – 686G>A, – 684G>A и – 617C>A гена NRF2 у европеоидов Новосибирской области. Работа проведена на 70 образцах крови детей 5-16 лет. Для полиморфизма G>A в положении – 686 и – 684 нами предложена аллель-специфичная ПЦР с праймерами следующих последовательностей: для аллеля – 686G: Forward (F) 5′-acacgtgggagttcagatgg-3′, Reverse (R) 5′-gaaaggcgttggtgtaggag-3′; для аллеля – 686A: F 5′-acacgtgggagttcagatga-3′, R 5′-gaaaggcgttggtgtaggag-3′. Для аллеля – 684G: F 5′-acgtgggagttcagaggtgg-3′, R 5′-gaaaggcgttggtgtaggag-3′; для аллеля – 684A: F 5′-acgtgggagttcagaggtga-3′, R 5′-gaaaggcgttggtgtaggag-3. Подбор праймеров и условий реакции осуществляли с помощью программы «Primer 3». Реакция проводилась в объеме 20 мкл, использовали 0,1 мкг геномной ДНК. ПЦР каждого образца ДНК проводили в двух пробирках. ДНК денатурировали в течение 5 мин при температуре 95°С, далее следовало 35 циклов 95°C-30 сек, 58 °C-15 сек, 72°C-20 сек, конечный цикл 72°С-5 мин. Длина продуктов амплификации составляла 270п.н. для – 686G>A и 268п.н. для – 684 G>A. Электрофорез проводили в 1,5% агарозном геле. В результате обеих ПЦР гомозиготы по любому аллелю имели продукт в одной из 2 пробирок, а гетерозиготы – в обеих. Для оценки полиморфизма – 617C>A нами предложен метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с праймерами следующих последовательностей: F 5′-gaatggagacacgtgggagt-3′ R 5′-ggctaaagatttggacccagac-3.’ Условия ПЦР были аналогичны приведенным выше, за исключением температуры отжига праймеров, равной 60°C. Продукт амплификации 171п.н. гидролизовали рестриктазой BstHH1 в течение 12ч при 50°C. Электрофорез проводили в 3 % агарозном геле. Гомозиготы по аллелю А имели 1 полосу 171п.н., гомозиготы по аллелю С – 2 полосы 106 и 65 п.н., гетерозиготы все 3 полосы. Частоты встречаемости аллелей составили: – 686А – 0.627, – 684 G – 0.9, – 617 C – 0.88. Распределение генотипов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Сравнение полученных нами частот аллелей 686G и 617C с данными по японской популяции выявило статистически значимые различия.