BioScience Blog – Научный Биологический блог

Одной из ранних ответных реакций растений на изменение условий является генерация активных форм кислорода (АФК), в том числе перекиси водорода, которая рассматривается как посредник в трансдукции сигналов [1]. Одним из ферментов, способным генерировать супероксид, является белок плазмалеммы НАДФН-оксидаза. Согласно молекулярно-биологическим исследованиям, гены НАДФН-оксидаз растений имеют гомологию с каталитической субъединицей gp91phox фагоцитов, содержат два EF-мотива в N-терминальной области и по этим признакам отнесены к семейству NOX5 [2]. В растениях с участием белков этого семейства связывают реализацию фитоиммунитета, апоптоза, роста и адаптации. В апопласте растительной клетки АФК способны продуцировать, по крайней мере, еще пероксидазы и аминооксидазы. Поэтому выявление индивидуальной роли НАДФН-оксидазы в указанных процессах представляет существенную методическую проблему. Поэтому целью исследования стала иммуноидентификация НАДФН-оксидазы и уровня ее активности в клетках корней и побегов проростков кукурузы. Плазмалемму получали разделением микросомальных мембран в двухфазной полимерной системе. Супероксид-продуцирующую активность плазмалеммы в присутствии НАДФН оценивали спектрофотометрически по восстановлению ХТТ. Белки плазмалеммы, способные генерировать супероксид, идентифицировали по определению молекулярной массы полос после нативного электрофореза, которые окрашивались формазаном, как продуктом восстановления NBT в НАДФН-оксидазной реакции. Присутствие НАДФН-оксидазы в плазмалемме подтверждали методом вестерн-блот анализа с использованием антител к каталитической субъединице gp91phox фагоцитов. Согласно результатам кинетики восстановления ХТТ НАДФН-оксидазной активностью обладали как плазмалемма клеток корней, так и побегов. При этом активность в обоих вариантах снижалась в среднем на 60% под влиянием дифенилфенелен иодониума (ДФИ) – ингибитора флавин-содержащих оксидаз. Белки в плазмалемме клеток побегов, способные продуцировать супероксид в присутствии НАДФН, имели молекулярные массы 50, 70 и 105 кД; а в плазмалемме корней – 50 и 70 кД. Только белки с массой 50 и 105 кД были чувствительны к ДФИ и выявлялись с антителами к gp91phox. Значение 105 кД, полученное нами, соответствует массам известных НАДФН-оксидаз плазмалеммы растительных клеток. Полоса 50 кД, скорее всего, является продуктом протеолиза этого белка. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности использования наших подходов для последующего выяснения механизмов участия белков этого типа в ответе растения на биотические и абиотические воздействия.

Литература: 1. Torres M.A., Dangl J.L.(2005). Functions of the repiratory burst oxidase in biotic interaction, abiotic stress and development. Curr. Opin. Plant Biol. 8: 397. 2. Kawahara T., Quinn M.T., Lambeth J.D. (2007) Molecular evolution of the reactive oxygen-generating NADPH oxidase (Nox/Duox) family of enzymes. BMC Evol. Biol. 7: 109.