BioScience Blog – Научный Биологический блог

Ежегодно повторяющиеся эпидемии гриппа, обусловленные способностью вируса гриппа изменять свою структуру, а также угроза возникновения новых пандемий в связи с появлением в циркуляции нового высокопатогенного штамма вируса гриппа H5N1, свидетельствуют о необходимости создания чувствительных, надежных и быстрых методов идентификации различных штаммов. Технология микрочипов является одним из наиболее эффективных современных методов для одновременного выявления присутствия множества различных вирусов в исследуемом образце. Целью представляемого исследования является создание олигонуклеотидного биочипа для выявления подтипа вируса гриппа типа А человека (ВГА) H5N1. Для последовательностей НА и NA ВГА человека H5N1, представленных в базе данных NCBI Influenza Virus Sequence Database было построено филогенетическое дерево с целью нахождения идентичных нуклеотидных сайтов. Нуклеотидные последовательности были выровнены между собой и к консервативным участкам в программе OligoWiz 2.0. были подобраны олигонуклеотидные зонды. Подобранные олигонуклеотидные зонды нанесли на аминосилановый субстрат при помощи споттера SpotArray24 (Perkin-Elmer, USA) методом контактной печати в условиях 50% влажности. Иммобилизация олигонуклеотидных зондов на поверхности подложки осуществлялась путем облучения на кросслинкере (Biometra, German). Стандартными методами биохимии выделили тотальную РНК из клеточных культур, содержащих референс-штаммы ВГА человека H5N1 A/HongKong/156/1997, A/HongKong/213/2003, A/Indonesia/5/2005, A/VietNam/1203/2004. Оптимизировали систему получения меченой кДНК с помощью обратной транскрипции, оценили эффективность получения СуЗ флуоресцентно меченых кДНК проб для гибридизации методами электрофореза и спектрофотометрии. Гибридизацию полученных меченых амплификатов с созданным микрочипом проводили в течение ночи при температуре 60°С. После гибридизации производили отмывку микрочипов и сканирование путем рассеивающего сканирования при длине волны 550 нм на сканере ScanArray Express (PerkinElmer, USA). На основании полученных результатов был разработан лабораторный образец олигонуклеотидного микрочипа для выявления вирусов гриппа типа А человека подтипов H5N1. В настоящий момент проводится апробация микрочипа.