Полуэктова Е.В., Попов В.Н. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАДН-ДЕГИДРОГЕНАЗ В МИТОХОНДРИЯХ TRITICUM AESTIVUM
Митохондрии обеспечивают не только регуляцию энергетического метаболизма в клетке, но и принимают непосредственное участие в ответе растений на стрессовые воздействия за счёт дополнительных систем, регулирующих разобщение окисления и фосфорилирования.
Отличительной особенностью митохондрий растений является способность растительных митохондрий окислять как экзогенный, так и эндогенный НАДН [1]. В митохондриях растений помимо ротенон-чувствительного I комплекса существует ряд ротенон-нечувствительных НАДН-дегидрогеназ, локализованных как с наружной («внешние» НАДН-дегидрогеназы), так и с внутренней («внутренние» НАДН-дегидрогеназы) стороны митохондриальной мембраны и передающих электроны на убихинон [2,3]. При этом следует отметить, что ни одна из ротенон-нечувствительных НАДН-дегидрогеназ не является протонтранслоцирующей [3]. В настоящее время известным фактом является активация «внешних» дегидрогеназ ионами Ca2+ [2]. Их активность коррелирует с усилением экспрессии альтернативной оксидазы и UCP-белков [4]. Отличительной особенностью «внутренней» дегидрогеназы является её нечувствительность к Ca2+ [5].
В связи с этим целью нашего исследования явилось электрофоретическое изучение НАДН-дегидрогеназ в митохондриях пшеницы.
В качестве объекта исследования использовали проростки пшеницы. Выделение митохондрий проводили с помощью дифференциального центрифугирования в среде выделения, содержащей 0,1М Tris-HCl буфер, рН 7,4, 3М сахарозу. Полученный осадок митохондрий промывали средой ресуспендирования того же состава с добавлением Triton X-100 без сахарозы.
Электрофоретическое разделение белков проводили методом вертикального электрофореза в 7,5% разделяющем и 3% концентрирующем полиакриламидном геле по модифицированному методу Дэвиса [6].
Среда проявления геля для НАДН-дегидрогеназ (1.6.99.1) содержала 0,1М Tris-HCl буфер, рН 8,3, 0,7мМ НАДН и 1мМ NST [7].
В ходе электрофоретического анализа изоферментного спектра НАДН-дегидрогеназ обнаружено три полосы активности, имеющие значение Rf 0,25, 0,33 и 0,43 (рис. 1а). При добавлении в среду проявления Ca2+ в концентрации 10мМ наблюдается появление в геле дополнительных полос активности НАДН-дегидрогеназы. Значения Rf для них составляют 0,64 и 0,71 (рис.1б). Полученные данные позволяют предположить, что именно эти формы соответствуют «внешним» НАДН-дегидрогеназам, поскольку ранее было показано, что данный фермент проявляет повышенную активность в присутствии Ca2+ [2]. Для того чтобы исключить возможность проявления НАДН-дегидрогеназ I комплекса дыхательной цепи, в среду проявления добавляли её ингибитор — ротенон в концентрации 9 мкМ. К сожалению, на электрофореграмме не обнаруживается исчезновение полос активности фермента по сравнению с контролем, что, возможно, объясняется высокой устойчивостью Комплекса I ЭТЦ растительных митохондрий к ротенону.
Таким образом, зависимость активности ДННА-дегидрогеназы от наличия в среде проявлении Ca2+ и ротенона подтверждает, что дополнительные полосы активности на электрофореграмме соответствуют именно «внешней» ротенон-нечувствительной НАДН-дегидрогеназе.
Литература
1. Douse R. Mitochondria in higher plants: structure, function and biogenesis. – London: Acad. Press, 1985. – 327 p.
2. Moller I.M. Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen species // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. – 2001. – V. 52. – P. 561-591.
3. Moller I.M. The oxidation of cytosolic NAD(P)H by external NAD(P)H dehydrogenases in the respiratory chain of plant mitochondria // Physiol. Plantarum. – 1997. – V. 100. – P. 85-90.
4. Michalecka A.M. et al. Identification of a mitochondrial external NADPH dehydrogenase by overexpression in transgenic Nicotiana sylvestris // Plant J. – 2004. – V. 37. – P. 415-425.
5. Agius S.C.
et al. The internal rotenone-insensitive NADPH dehydrogenase contributes to malate oxidation by potato tuber and pea leaf mitochondria // Physiologia Plantarum. – 1998. – V. 104. – P. 329-336.
6. Davis B.J. et al. Disk Elektrophoresis : method and application to human surum proteins // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1964. – V. 121. – P. 404-427.
7. Левитес Е.В. Генетика изоферментов растений. — Новосибирск.: Изд-во «Наука», 1986. – C. 32.
Загрузка ...