BioScience Blog – Научный Биологический блог

Шаперонин TRiC (TCP-1 Ring Complex) осуществляет сворачивание ряда белков в цитоплазме эукариотических клеток. Хотя изначально предполагалось, что данный шаперонин осуществляет лишь фолдинг белков цитоскелета, таких как актин и тубулин, количество других известных субстратов TRiC постоянно увеличивается. На настоящий момент известно, что TRiC взаимодействует примерно с 10% всех синтезируемых в цитоплазме белков. На первом этапе работы были проанализированы представленные в литературе данные относительно источников, в которых количество изучаемого шаперонина было наибольшее. Оказалось, что одним из них являются семенники. Ранее в нашей лаборатории было показано, что субстратами для шаперонина TriC, кроме уже известных актина и тубулина, также является, по крайней мере, один из ферментов гликолиза – лактатдегидрогеназа. Кроме этого, было продемонстрировано связывание денатурированной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД), выделенной из скелетных мышц кролика, с TRiC. Продолжая ранее проведенные исследования, виделось целесообразным определить субстраты для данного шаперонина, которые могут присутствовать в цитоплазме клеток семенников. Поэтому, следующим объектом изучения стала сперматозоидная глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД-С). Для получения фермента мы использовали клетки E.coli, трансформированные плазмидой, содержащей ген, кодирующий ГАФД-С, у которого на месте N-концевого домена, при помощи которого он крепится к фиброзному слою, был «пришит» гидрофобный хитин-связывающий домен. Таким образом, полученный фермент являлся аналогом сперматозоидного. В первую очередь, мы инкубировали нативную ГАФД-С с TRiC, для того чтобы определить возможность взаимодействия шаперонина с гидрофобным хвостом. Было показано, что в процессе инкубации изменения активности не происходило, что, вероятно, говорит об отсутствии связывания. Для исследования возможности взаимодействия денатурированной ГАФД-С с шаперонином и ее фолдинга, мы денатурировали фермент в присутствии 4 М GdHCl. В процессе инкубации отбирали аликвоты для измерения ферментативной активности ГАФД-С. Было показано, что в течение 5-6 часов белок полностью терял свою активность. Для инициации рефолдинга денатурированный фермент разводили в 100 раз буфером для реактивации и следили за восстановлением активности. Нами было показано, во-первых, что денатурированная ГАФД-С взаимодействует с TriC, а, во-вторых, уровень реактивации ГАФД-С в присутствии шаперонина превышает уровень спонтанной в 3 раза. Мы предполагаем, что представленные результаты, а также проведенные нами ранее опыты по реактивации ГАФД, выделенной из мышц кролика, могут служить одним из доказательств гипотезы относительно вовлечения данного шаперонина в формирование фиброзного слоя хвостов сперматозоидов и «прикрепления» ГАФД-С к нему. Наши эксперименты могут также объяснить высокую концентрацию TRiC именно в семенниках, хотя такого рода предположения, конечно, требуют дальнейших экспериментальных исследований и доказательств.